人類γ基因啟動子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn),該位點(diǎn)結(jié)合BCLllA蛋白后,γ基因的表達(dá)被抑制。通過改變該結(jié)合位點(diǎn)的序列,解除對γ基因表達(dá)的抑制,可對某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療??蒲腥藛T擴(kuò)增了γ基因上游不同長度的片段,將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測,以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置,相關(guān)信息如圖所示。回答下列問題:
?
(1)為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá),需在引物末端添加限制酶識別序列。據(jù)圖可知,在F1~F7末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是
SalⅠ
SalⅠ
,在R末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是
EcoRⅠ
EcoRⅠ
。本實(shí)驗(yàn)中,從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過程共需要
6
6
種酶。
(2)將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細(xì)胞,成功轉(zhuǎn)化后,含F(xiàn)1~F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白,受體細(xì)胞有熒光,含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光。含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光的原因是
F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動子,熒光蛋白基因不表達(dá)
F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動子,熒光蛋白基因不表達(dá)
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(3)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素,含F(xiàn)1~F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光,而含F(xiàn)5~F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列,據(jù)此結(jié)果可推測,BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于
引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上
引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上
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