25.人類γ基因啟動子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點,該位點結(jié)合BCLllA蛋白后,γ基因的表達被抑制。通過改變該結(jié)合位點的序列,解除對γ基因表達的抑制,可對某種地中海貧血癥進行基因治療??蒲腥藛T擴增了γ基因上游不同長度的片段,將這些片段分別插入表達載體中進行轉(zhuǎn)化和熒光檢測,以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點的具體位置,相關(guān)信息如圖所示?;卮鹣铝袉栴}:
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(1)為將擴增后的產(chǎn)物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達,需在引物末端添加限制酶識別序列。據(jù)圖可知,在F1~F7末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是
,在R末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是
。本實驗中,從產(chǎn)物擴增到載體構(gòu)建完成的整個過程共需要
種酶。
(2)將構(gòu)建的載體導入除去BCL11A基因的受體細胞,成功轉(zhuǎn)化后,含F(xiàn)1~F6與R擴增產(chǎn)物的載體表達熒光蛋白,受體細胞有熒光,含F(xiàn)7與R擴增產(chǎn)物的受體細胞無熒光。含F(xiàn)7與R擴增產(chǎn)物的受體細胞無熒光的原因是
。
(3)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素,含F(xiàn)1~F4與R擴增產(chǎn)物的受體細胞不再有熒光,而含F(xiàn)5~F6與R擴增產(chǎn)物的受體細胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點序列,據(jù)此結(jié)果可推測,BCL11A蛋白結(jié)合位點位于
。