癌細胞表面蛋白“PDL-1”與T細胞表面蛋白“PD-1”特異性結(jié)合后,可抑制T細胞活性并啟動其凋亡程序,導(dǎo)致腫瘤細胞發(fā)生免疫“逃逸”。研究者對“PD-1”基因進行克隆、表達及生物學(xué)活性鑒定,為制備抗體打基礎(chǔ)。研究中所用引物α和β堿基序列見圖1,幾種常用限制酶名稱及識別序列與酶切位點見圖2:
(1)首先提取細胞中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA作為模板:設(shè)計含有不同的限制酶切位點的α和β序列為引物,通過
PCR
PCR
技術(shù)擴增目的基因。
(2)為保證目的基因和載體正向連接,選用圖中的名稱為
Xho I、EcoR I
Xho I、EcoR I
的限制酶將質(zhì)粒和目的基因進行切割,再用DNA連接酶構(gòu)建表達載體。該表達載體的組成,除了目的基因、標(biāo)記基因(抗卡那霉素基因)外,還必須具有
啟動子、終止子、復(fù)制原點
啟動子、終止子、復(fù)制原點
等(寫出2點即可)。
(3)而后一定溫度下,與經(jīng)過Ca
2+處理的感受態(tài)大腸桿菌混合培養(yǎng)在含
卡那霉素
卡那霉素
培養(yǎng)基中,可篩選出已經(jīng)完成轉(zhuǎn)化的大腸桿菌,繼續(xù)培養(yǎng)該種大腸桿菌以擴增重組DNA。
(4)將擴增后的“載體A/PD-1重組DNA”轉(zhuǎn)入可高度表達外源基因的原代293T細胞。一段時間后,為確定PD-1基因是否表達,檢測細胞膜表面是否具有
PD-1蛋白
PD-1蛋白
。研究中還會有一步驟是只將載體A轉(zhuǎn)入293T細胞,其目的是
作為(陰性)對照,從而排除載體A本身序列對實驗結(jié)果的影響
作為(陰性)對照,從而排除載體A本身序列對實驗結(jié)果的影響
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