RBD是新型冠狀病毒表面囊膜S蛋白的受體結(jié)合域肽段。Fc為人源抗體IgGⅠ的部分重鏈,能通過(guò)二硫鍵相結(jié)合形成Fc二聚體??蒲腥藛T為研制重組蛋白疫苗,構(gòu)建了融合表達(dá)RBD和Fc的重組質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)流程圖1如下,請(qǐng)回答下列問(wèn)題。
(1)通過(guò)重疊延伸PCR(重疊鏈相互搭橋、互為模板而延伸,最終將不同來(lái)源的DNA片段拼接起來(lái))獲取融合基因。
①第一次PCR和第二次PCR的反應(yīng)體系中不同的有
引物種類(lèi)和模板DNA
引物種類(lèi)和模板DNA
,第一次PCR中至少經(jīng)
2
2
次擴(kuò)增,可得到末端平齊且含引物2的產(chǎn)物;
②有關(guān)基因序列如圖2,據(jù)圖分析,引物1和引物4應(yīng)選擇下列選項(xiàng)的
AB
AB
。
A.5'CTTGTACAG-----3'
B.5'TGGTTGTGG-----3'
C.5'GCTCACCAT-----3'
D.5'CCACAACCA-----3'
③經(jīng)第三次PCR獲取融合基因,第三次PCR比第一次PCR延伸所需時(shí)間
長(zhǎng)
長(zhǎng)
(填“長(zhǎng)”或“短”),原因是
第三次PCR中待擴(kuò)增的片段長(zhǎng)
第三次PCR中待擴(kuò)增的片段長(zhǎng)
。
(2)構(gòu)建基因表達(dá)載體
分步實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/td>
| 簡(jiǎn)易操作 |
酶切融合基因和質(zhì)粒pCDNA3.1 |
37℃條件下,酶切8小時(shí),電泳鑒定、回收;酶切位點(diǎn)應(yīng)添加在引物1和4的① 5' 5' 端 |
獲取重組質(zhì)粒 |
將上述融合基因、質(zhì)粒和② DNA連接 DNA連接 酶一起加入反應(yīng)體系,16℃反應(yīng)過(guò)夜 |
利用大腸桿菌③ 擴(kuò)增重組質(zhì)粒 擴(kuò)增重組質(zhì)粒 |
將產(chǎn)物加入感受態(tài)大腸桿菌培養(yǎng)液,培養(yǎng)過(guò)夜,提取更多重組質(zhì)粒 |
(3)將目的基因?qū)肴伺咛ツI細(xì)胞將重組質(zhì)粒、聚乙烯亞胺溶液加入到狀態(tài)良好的人胚胎腎細(xì)胞培養(yǎng)液中,培養(yǎng)4~5天,分離純化融合表達(dá)蛋白,推測(cè)聚乙烯亞胺溶液的作用是
使重組DNA進(jìn)入受體細(xì)胞
使重組DNA進(jìn)入受體細(xì)胞
。
(4)已知RBD二聚體疫苗比RBD單體疫苗效果更優(yōu),推斷重組蛋白中Fc的作用是
有效介導(dǎo)RBD二聚體的形成,并降低人體免疫排斥反應(yīng)
有效介導(dǎo)RBD二聚體的形成,并降低人體免疫排斥反應(yīng)
。