1．某動(dòng)物體內(nèi)含有研究者感興趣的目的基因，研究者欲將該基因?qū)氪竽c桿菌的質(zhì)粒中保存。該質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、LacZ基因及一些酶切位點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)和簡(jiǎn)單的操作步驟如圖所示?；卮鹣铝袉?wèn)題：

（1）制備重組質(zhì)粒常用同種限制酶的原因是能產(chǎn)生 。為了使質(zhì)粒DNA與目的基因能連接形成重組質(zhì)粒，還需要在混合物中加 。
（2）培養(yǎng)基中除了加入大腸桿菌所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還需要添加 以便篩選導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌。
（3）為了使大腸桿菌處于一種能 的生理狀態(tài)，一般先用Ca²⁺處理大腸桿菌細(xì)胞。
（4）將質(zhì)粒和目的基因的混合物與上述處理后的大腸桿菌混勻，制備轉(zhuǎn)基因大腸桿菌，取0.1ml上述溶液采用 法接種于培養(yǎng)基表面，在37℃下倒置培養(yǎng)16 h。經(jīng)培養(yǎng)后，分別統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)目的基因大腸桿菌的菌落數(shù)和總菌落數(shù)，并計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。理論上轉(zhuǎn)目的基因受體菌的菌落呈現(xiàn) 色，原因是 。實(shí)驗(yàn)中實(shí)際轉(zhuǎn)化效率介于50%～85.7%，原因是 。

2．HSV-1是單純皰疹病毒的一種類型，HSV-1病毒顆粒的組裝主要由包裝信號(hào)序列（a′）介導(dǎo)?？蒲腥藛T從HSV-1基因組中分離出a′，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了質(zhì)粒pHSL并進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，流程如圖1。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。

注：LacZ的表達(dá)產(chǎn)物β-半乳糖苷酶能將無(wú)色化合物X-gal水解產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)而使細(xì)胞變藍(lán)
（1）過(guò)程①先用 酶將HSV-1的DNA酶解成若干片段，再利用 與含有a′的酶解片段進(jìn)行雜交，根據(jù)陽(yáng)性信號(hào)逐步篩選出盡可能短的a′所在片段。
（2）過(guò)程②中使用的限制酶是 。過(guò)程③采用的方法是 。過(guò)程④在轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)Vero細(xì)胞時(shí)，常在培養(yǎng)液中添加動(dòng)物血清，其目的是 。
（3）tsK株是具有感染性的HSV-1溫度敏感株。在tsK株的輔助下，pHSL能組裝成假病毒（不含完整病毒基因組的顆粒），從而獲得tsK株和含假病毒的混合毒株。圖2是Vero細(xì)胞連續(xù)傳代過(guò)程中，混合毒株的滴度（代表單位體積液體中病毒顆粒的多少）變化曲線及每代中假病毒的占比（柱形圖）。
①研究中，選用 代混合毒株用于后續(xù)神經(jīng)細(xì)胞的接種實(shí)驗(yàn)可減少tsK株可能造成的細(xì)胞毒性，理由是 。
②為驗(yàn)證假病毒能否感染體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞并表達(dá)LacZ基因，科研人員將混合毒株與大鼠神經(jīng)細(xì)胞按一定比例在 ℃下混合培養(yǎng)48h,用含 （物質(zhì)）的檢測(cè)液檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大約20%的細(xì)胞變藍(lán)，說(shuō)明 。

3．癌細(xì)胞表面蛋白“PDL-1”與T細(xì)胞表面蛋白“PD-1”特異性結(jié)合后，可抑制T細(xì)胞活性并啟動(dòng)其凋亡程序，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫“逃逸”。研究者對(duì)“PD-1”基因進(jìn)行克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性鑒定，為制備抗體打基礎(chǔ)。研究中所用引物α和β堿基序列見(jiàn)圖1，幾種常用限制酶名稱及識(shí)別序列與酶切位點(diǎn)見(jiàn)圖2：

（1）首先提取細(xì)胞中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA作為模板：設(shè)計(jì)含有不同的限制酶切位點(diǎn)的α和β序列為引物，通過(guò) 技術(shù)擴(kuò)增目的基因。
（2）為保證目的基因和載體正向連接，選用圖中的名稱為 的限制酶將質(zhì)粒和目的基因進(jìn)行切割，再用DNA連接酶構(gòu)建表達(dá)載體。該表達(dá)載體的組成，除了目的基因、標(biāo)記基因（抗卡那霉素基因）外，還必須具有 等（寫(xiě)出2點(diǎn)即可）。
（3）而后一定溫度下，與經(jīng)過(guò)Ca²⁺處理的感受態(tài)大腸桿菌混合培養(yǎng)在含 培養(yǎng)基中，可篩選出已經(jīng)完成轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，繼續(xù)培養(yǎng)該種大腸桿菌以擴(kuò)增重組DNA。
（4）將擴(kuò)增后的“載體A/PD-1重組DNA”轉(zhuǎn)入可高度表達(dá)外源基因的原代293T細(xì)胞。一段時(shí)間后，為確定PD-1基因是否表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞膜表面是否具有 。研究中還會(huì)有一步驟是只將載體A轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，其目的是 。