T-2毒素是一種常見的霉菌毒素,可通過污染飼料引起畜禽中毒反應(yīng)。CYP3A是豬體內(nèi)降解T-2毒素的關(guān)鍵酶,T-2毒素可誘導(dǎo)其表達水平升高。
(1)T-2毒素是一種脂溶性小分子,以
自由擴散
自由擴散
方式進入細胞。
(2)CCAAT box和GC box是CYP3A基因啟動子上游的兩個調(diào)控序列,研究者將不同調(diào)控序列分別和CYP3A基因啟動子及熒光素酶基因(LUC基因)連接構(gòu)建表達載體,導(dǎo)入豬肝細胞,實驗組培養(yǎng)基中加入T-2毒素,對照組的處理是
導(dǎo)入含CYP3A基因啟動子及LUC基因的載體,培養(yǎng)基中加入等量T-2毒素
導(dǎo)入含CYP3A基因啟動子及LUC基因的載體,培養(yǎng)基中加入等量T-2毒素
。24h后檢測LUC酶活性,計算啟動子活性相對值,結(jié)果如圖1。據(jù)圖1可知,這兩個調(diào)控序列是CYP3A基因響應(yīng)T-2毒素的核心元件,理由是
缺失兩個調(diào)控序列或其中任一個,T-2毒素都不能誘導(dǎo)啟動子活性增強
缺失兩個調(diào)控序列或其中任一個,T-2毒素都不能誘導(dǎo)啟動子活性增強
。
(3)NF-Y和Sp1兩種蛋白均參與T-2毒素對CYP3A的誘導(dǎo)。已有研究表明,GC box是Sp1的結(jié)合位點。研究者推測,NF-Y通過與CCAAT box結(jié)合,與Sp1共同調(diào)控CYP3A基因的表達。
①依據(jù)CCAAT box序列,研究者制備NF-Y結(jié)合位點野生型及突變型探針,分別與豬肝細胞核蛋白提取物混合,結(jié)果如圖2。結(jié)果證明CCAAT box是NF-Y的結(jié)合位點。請解釋第4、5組實驗現(xiàn)象出現(xiàn)的原因
結(jié)合位點突變的探針不能結(jié)合核蛋白中的NF-Y,也不會競爭NF-Y與標記探針的結(jié)合,所以第4組與第2組同樣位置出現(xiàn)阻滯帶,第5組,NF-Y的抗體結(jié)合NF-Y,因此第5組中出現(xiàn)標記探針、NF-Y和NF-Y抗體的結(jié)合物,結(jié)合物分子量大,阻滯帶的位置更靠后
結(jié)合位點突變的探針不能結(jié)合核蛋白中的NF-Y,也不會競爭NF-Y與標記探針的結(jié)合,所以第4組與第2組同樣位置出現(xiàn)阻滯帶,第5組,NF-Y的抗體結(jié)合NF-Y,因此第5組中出現(xiàn)標記探針、NF-Y和NF-Y抗體的結(jié)合物,結(jié)合物分子量大,阻滯帶的位置更靠后
。
②抑制豬肝細胞中NF-Y或Sp1的表達,發(fā)現(xiàn)CYP3A的mRNA水平顯著下調(diào),說明NF-Y和Sp1均能夠
促進
促進
豬CYP3A基因的表達。CCAAT box和GC box在DNA上的位置很近,研究者改變二者的距離,并檢測CYP3A基因的啟動子活性,發(fā)現(xiàn)延長或縮短它們之間的距離都會
降低CYP3A基因啟動子的活性
降低CYP3A基因啟動子的活性
,這一結(jié)果支持了NF-Y和Sp1通過互作共同發(fā)揮調(diào)控功能的推測。
(4)N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶(OGT)促進Sp1的糖基化修飾水平,抑制Sp1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能;O-糖苷酶(OGA)可以使Sp1去糖基化修飾,增強Sp1與互作蛋白的互作。研究者用T-2毒素處理豬肝細胞,檢測OGT和OGA的表達量,結(jié)果如圖3。結(jié)合圖3及上述系列實驗結(jié)果,請闡述T-2毒素進入豬體內(nèi)后的代謝調(diào)控機制。
T-2毒素進入豬的肝細胞→促進OGA的表達→抑制Sp1糖基化修飾,增強Sp1與NF-Y的互作→CYP3A啟動子的活性增強,基因表達水平提高→催化T-2毒素降解代謝
T-2毒素進入豬的肝細胞→促進OGA的表達→抑制Sp1糖基化修飾,增強Sp1與NF-Y的互作→CYP3A啟動子的活性增強,基因表達水平提高→催化T-2毒素降解代謝
。