啟動(dòng)子可分為組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
35S啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子,能夠持續(xù)、高效地啟動(dòng)目的基因在植物各種組織中的表達(dá),但往往也會(huì)阻礙植物的生長(zhǎng)發(fā)育;Rd29A啟動(dòng)子是一種逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。沙冬青脫水素基因(AmDHN基因)能使植株具有較強(qiáng)的抗旱作用。科研人員構(gòu)建Rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)AmDHN基因表達(dá)的載體,過(guò)程如圖1。再利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化“敖漢苜?!蹦秃敌缕贩N,以期在干旱地區(qū)發(fā)展苜蓿產(chǎn)業(yè)。
限制酶 |
BclⅠ |
SacⅠ |
BamHⅠ |
PstⅠ |
SmaⅠ |
識(shí)別序列和切割位點(diǎn) |
T↓GATCA |
GAGCT↓C |
G↓GATCC |
CTGCA↓G |
CCC↓GGG |
回答下列問(wèn)題:
?
(1)科研人員擴(kuò)增Rd29A啟動(dòng)子所設(shè)計(jì)的引物如下,根據(jù)引物的堿基序列及限制酶的識(shí)別序列分析,構(gòu)建載體2時(shí)選用的限制酶是
SmaI和SacI
SmaI和SacI
。為了提高構(gòu)建載體3的成功率,選用
BclI和SacI
BclI和SacI
酶切割載體1、2。
上游引物P1:5'-GA
CCCGGGTTTCCAAAGATTTTTTTC-3'
下游引物P2:5'-GA
GAGCTCTGGGGTTTTGCTTTTGAATGT-3'
(2)載體5需先轉(zhuǎn)入
農(nóng)桿菌
農(nóng)桿菌
后再轉(zhuǎn)化苜蓿,轉(zhuǎn)化后應(yīng)在培養(yǎng)基中添加
新霉素
新霉素
,以篩選轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織。
(3)為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因苜蓿中AmDHN基因的轉(zhuǎn)錄水平,挑選10株轉(zhuǎn)基因植株,利用自來(lái)水和20%PEG(模擬干旱條件)處理8h,提取RNA通過(guò)RT-PCR檢測(cè)AmDHN基因和MtActin基因(一種骨架蛋白基因)的表達(dá)水平,其結(jié)果如圖2:
①選擇MtActin基因轉(zhuǎn)錄水平作為參照的依據(jù)是MtActin基因在各細(xì)胞中表達(dá)
相對(duì)恒定
相對(duì)恒定
。
12345123AmDHN②自來(lái)水處理和20%PEG條件下的AmDHN基因表達(dá)水平的差異說(shuō)明:
干旱能誘導(dǎo)Rd29A啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄
干旱能誘導(dǎo)Rd29A啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄
。