四環(huán)素被廣泛應用于治療人及動物的細菌感染，但殘留在動物組織、奶制品中的四環(huán)素通過食物鏈進入人體，會對人類健康造成威脅。為保障食品安全和人類健康，科研人員向大腸桿菌體內(nèi)導入了一些特殊的DNA序列作為生物傳感器，從而建立一種簡易、靈敏以及準確的四環(huán)素檢測方法。
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（1）研究者利用如圖1所示的原理設計四環(huán)素檢測傳感器（圖中GFP為綠色熒光蛋白基因）。當環(huán)境中有四環(huán)素時，菌體

能

能

（填“能”或者“不能”）發(fā)出綠色熒光，原因是

四環(huán)素能解除R蛋白對啟動子B的抑制作用

四環(huán)素能解除R蛋白對啟動子B的抑制作用

。因此可以通過檢測熒光強弱來判定環(huán)境中的四環(huán)素濃度。
（2）研究者利用基因工程技術構建含四環(huán)素檢測傳感器的大腸桿菌工程菌。
①利用如圖2所示的質粒1和質粒2，構建同時含片段1和片段2的表達載體，可用限制酶E、X和

E、S

E、S

分別處理質粒1和質粒2，再用DNA連接酶連接。（四種限制酶的識別序列及切割位點如下表所示）

限制酶	E	X	S	P
識別序列及切割位點	5′…G↓AATTC…3′ 3′…CTTAA↑G…5′	5′…T↓CTAGA…3′ 3′…AGATC↑T…5′	5′…A↓CTAGT…3′ 3′…TGATC↑A…5′	5′…CTGCA↓G…3′ 3′…G↑ACGTC…5′

②研究者通過上述方法將所有的啟動子和相應基因的DNA片段與載體連接，構建表達載體，導入用

CaCl₂

CaCl₂

處理的大腸桿菌細胞內(nèi)。經(jīng)過篩選，獲得工程菌。
（3）研究者發(fā)現(xiàn)在四環(huán)素濃度較低時，隨四環(huán)素濃度增加，工程菌的熒光強度變化不明顯。欲獲得檢測靈敏度更高的傳感器，參照（1）中的原理圖，從以下選項中選擇啟動子和基因，構建表達載體并轉入大腸桿菌后篩選，則啟動子和基因最合適的組合應為①A②

C

C

③

D

D

，該組合檢測靈敏度更高的原因是

添加T7基因，可表達T7RNA聚合酶，其活性比大腸桿菌RNA聚合酶更高，可增強相關基因的表達，sfGFP基因，表達熒光強度和穩(wěn)定性較高綠色熒光蛋白，進而增強檢測的靈敏度。

添加T7基因，可表達T7RNA聚合酶，其活性比大腸桿菌RNA聚合酶更高，可增強相關基因的表達，sfGFP基因，表達熒光強度和穩(wěn)定性較高綠色熒光蛋白，進而增強檢測的靈敏度。

。
Ⅰ.啟動子：
①啟動子A
②啟動子B
③經(jīng)T7RNA聚合酶特異性誘導開啟的啟動子
Ⅱ.基因：
A.R基因
B.GFP基因
C.T7基因（表達T7RNA聚合酶，其活性比大腸桿菌RNA聚合酶更高）
D.sfGFP基因（表達熒光強度和穩(wěn)定性都高于GFP的綠色熒光蛋白）