苯丙酮尿癥是單基因遺傳病，科學(xué)家將正?；駾導(dǎo)入該病患者的細(xì)胞，以治療該病。圖甲為質(zhì)粒，長度為2.7kb。其中Ap為氨芐青霉素抗性基因；lacZ為藍(lán)色顯色基因，其表達(dá)產(chǎn)物可以將無色化合物X-gal轉(zhuǎn)化成藍(lán)色物質(zhì)，使菌落呈藍(lán)色；EcoRⅠ（0.6Kb）、PvuⅠ（0.8Kb）為限制酶及其切割位點與復(fù)制原點之間的距離。圖乙為含有目的基因D的DNA片段?；卮鹣铝袉栴}：

（1）利用PCR技術(shù)獲取目的基因D時，設(shè)計引物的依據(jù)是

目的基因D兩端的堿基序列

目的基因D兩端的堿基序列

，引物的長度通常為

20～30

20～30

個核苷酸，之所以需要引物是由于

DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈

DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈

。在PCR反應(yīng)體系中除了引物、DNA模板之外，還有

4種脫氧核苷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、耐高溫的DNA聚合酶、Mg²⁺、緩沖液

4種脫氧核苷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、耐高溫的DNA聚合酶、Mg²⁺、緩沖液

。
（2）構(gòu)建基因表達(dá)載體時，需將目的基因D和質(zhì)粒分別用

PvuI

PvuI

進(jìn)行切割，然后它們混合在一起，添加

DNA連接

DNA連接

酶，得到的產(chǎn)物有

目的基因D正向接入的重組質(zhì)粒、目的基因D反向接入的重組質(zhì)粒、沒有接入目的基因D的質(zhì)粒自身環(huán)化的產(chǎn)物、目的基因D自身環(huán)化的產(chǎn)物

目的基因D正向接入的重組質(zhì)粒、目的基因D反向接入的重組質(zhì)粒、沒有接入目的基因D的質(zhì)粒自身環(huán)化的產(chǎn)物、目的基因D自身環(huán)化的產(chǎn)物

。
（3）為選出符合要求的重組質(zhì)粒，使用EcoRⅠ對質(zhì)粒完全酶切后，進(jìn)行電泳分析。若是符合要求的重組質(zhì)粒，電泳圖譜中出現(xiàn)條帶長度為

1.2kb和5.5kb

1.2kb和5.5kb

。
（4）利用自身不含lacZ基因且對抗生素敏感的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，要篩選出已轉(zhuǎn)化的含重組質(zhì)粒，培養(yǎng)基中應(yīng)添加

氨芐青霉素和X-gal

氨芐青霉素和X-gal

，其中符合要求的菌落為

白色菌落

白色菌落

。