In-Fusion技術(shù)是一項(xiàng)新型的無(wú)縫克隆技術(shù)。該技術(shù)關(guān)鍵是要在目的基因兩端構(gòu)建與線性化質(zhì)粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常為15-20bp），然后用In-Fusion 酶處理即可實(shí)現(xiàn)無(wú)縫連接。它的操作步驟大致為：①質(zhì)粒線性化；②PCR擴(kuò)增出兩端含線性化質(zhì)粒同源序列的目的基因；③目的基因與線性化質(zhì)粒同源區(qū)域在In-Fusion酶作用下形成重組質(zhì)粒；④將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞。
（1）過程①中需要用到的酶有
TaqDNA聚合酶
TaqDNA聚合酶
。另外，利用 限制酶
限制酶
處理也可以直接得到線性化質(zhì)粒。
（2）據(jù)圖分析，為保證擴(kuò)增出所需的目的基因，引物A或引物B要依據(jù) 目的基因和質(zhì)粒
目的基因和質(zhì)粒
序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。過程②經(jīng)過 3
3
輪循環(huán)即可初步得到符合要求的目的基因片段。
（3）過程③中，同源序列1、2中的堿基排序不同，這樣設(shè)計(jì)的好處是 防止目的基因反向連接；防止線性化質(zhì)粒或目的基因的自身環(huán)化
防止目的基因反向連接；防止線性化質(zhì)?；蚰康幕虻淖陨憝h(huán)化
。圖示In-Fusion技術(shù)可作為模型使用，一般來(lái)說(shuō)只需要改變圖中的 引物A和引物B
引物A和引物B
，即可快速構(gòu)建出另一種目的基因的重組質(zhì)粒。
（4）若目的基因是氨芐青霉素抗性基因，以大腸桿菌作為受體細(xì)胞時(shí)，過程④需要用 Ca2+
Ca2+
處理大腸桿菌。為檢測(cè)已轉(zhuǎn)化大腸桿菌的抗性效果，在含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，分別用顯微鏡計(jì)數(shù)法和 稀釋涂布平板
稀釋涂布平板
法進(jìn)行計(jì)數(shù)，若計(jì)數(shù)結(jié)果分別是M、N，則致死率可用（ M-N）/Mx 100%表示，此結(jié)果較真實(shí)值偏大，原因是 在用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)時(shí)，當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，在平板上觀察到的是一個(gè)菌落
在用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)時(shí)，當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，在平板上觀察到的是一個(gè)菌落
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