紹興故有“黃酒之鄉(xiāng)”之稱(chēng)，黃酒是中國(guó)最古老的酒種，享有“酒中之祖、酒中之王”的美譽(yù)，深得大眾喜愛(ài)。但研究發(fā)現(xiàn)黃酒中的潛在致癌物質(zhì)——氨基甲酸乙酯（EC）的含量遠(yuǎn)高于其他酒。已知酒液中的EC主要由尿素和乙醇反應(yīng)生成，而尿素主要由酵母菌代謝產(chǎn)生。

如圖1為酵母菌細(xì)胞中尿素的來(lái)源去路：
請(qǐng)回答：
（1）降低黃酒中EC含量的關(guān)鍵是

降低黃酒中尿素的含量

降低黃酒中尿素的含量

。
（2）從基因角度分析，降低黃酒中EC含量的方法有：

抑制CAR1基因的表達(dá)

抑制CAR1基因的表達(dá)

或增強(qiáng)DUR1，2基因的表達(dá)。
（3）強(qiáng)啟動(dòng)子具有與

RNA聚合酶

RNA聚合酶

結(jié)合，并多次啟動(dòng)

轉(zhuǎn)錄

轉(zhuǎn)錄

過(guò)程的功能，將目的基因（DUR1，2基因）與強(qiáng)啟動(dòng)子結(jié)合可以增強(qiáng)目的基因的表達(dá)。
①要獲取目的基因，可以從

cDNA文庫(kù)

cDNA文庫(kù)

中釣取，獲得的目的基因不含啟動(dòng)子，再進(jìn)行

PCR

PCR

擴(kuò)增。
②如圖2為目的基因部分序列：
應(yīng)選擇的一對(duì)引物是：

AC

AC

。
A．5'-ATGACAGTTAGT-3'
B．5'-TACTGCCGGTGA-3'
C．5'-TCACCGGCAGTA-3'
D．5'-ACTAACTGTCAT-3'
③如圖3所示，構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)為避免反向拼接應(yīng)選擇

EcoRⅠ和BamHⅠ

EcoRⅠ和BamHⅠ

識(shí)別切割質(zhì)粒，再用

DNA連接酶

DNA連接酶

連接。已知目的基因上無(wú)相關(guān)酶切位點(diǎn)，應(yīng)在引物的

5'

5'

（填“5'”或“3'”）端設(shè)計(jì)酶切序列，目的基因上游設(shè)計(jì)的酶切序列+引物序列為5'-

GAATTCATGACAGTTAGT

GAATTCATGACAGTTAGT

-3'。
④已知DUR1，2基因的轉(zhuǎn)錄模板鏈為A鏈，若DUR1，2基因反向連接，構(gòu)建出反義DUR1，2基因，則其轉(zhuǎn)錄模板鏈為

B

B

鏈。造成的結(jié)果是轉(zhuǎn)反義DUR1，2基因酵母工程菌中內(nèi)源的DUR1，2基因表達(dá)受阻，原因可能是

以B鏈為模板轉(zhuǎn)錄出的RNA與以A鏈為模板轉(zhuǎn)錄出的RNA配對(duì)形成雙鏈，抑制了DUR1，2基因的表達(dá)

以B鏈為模板轉(zhuǎn)錄出的RNA與以A鏈為模板轉(zhuǎn)錄出的RNA配對(duì)形成雙鏈，抑制了DUR1，2基因的表達(dá)

。