苯丙酮尿癥是由PKU基因突變引起的，基因定點(diǎn)整合可以將正常PKU基因定點(diǎn)整合到PKU基因突變的小鼠胚胎干細(xì)胞的染色體DNA上，替換突變基因，用于研究該病的治療。基因定點(diǎn)整合的過(guò)程是：從染色體DNA的突變PKU基因兩側(cè)各選擇一段DNA序列HB1和HB2，根據(jù)其堿基序列分別合成HB1和HB2，再將兩者分別與基因K1、K2連接，中間插入正常PKU基因和標(biāo)記基因neo^r，構(gòu)建出如圖所示的重組載體。重組載體和染色體DNA中的HB1和HB2序列發(fā)生交換，導(dǎo)致兩者之間區(qū)域發(fā)生互換（如圖）。

（1）構(gòu)建重組載體時(shí)，需采用PCR技術(shù)對(duì)PKU基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的原理是

DNA復(fù)制

DNA復(fù)制

。擴(kuò)增時(shí)，需要先加熱至90～95℃使DNA解鏈后，后冷卻至55～60℃的目的是

使引物和模板鏈互補(bǔ)配對(duì)

使引物和模板鏈互補(bǔ)配對(duì)

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（2）重組載體中的HB1和HB2之間除了插入正常的PKU基因和neo^r基因以外，還必須含有

啟動(dòng)子、終止子

啟動(dòng)子、終止子

。neo^r基因的作用是

選擇出成功導(dǎo)入目的基因的受體細(xì)胞

選擇出成功導(dǎo)入目的基因的受體細(xì)胞

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（3）用圖中重組載體轉(zhuǎn)化時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一些PKU基因錯(cuò)誤整合的胚胎干細(xì)胞。錯(cuò)誤整合時(shí)，載體的兩個(gè)K基因中至少會(huì)有一個(gè)與neo^r基因一起整合到染色體DNA上，已知含有neo^r基因的細(xì)胞具有G418的抗性。K1、K2的產(chǎn)物都能把DHPG轉(zhuǎn)化成有毒物質(zhì)而使細(xì)胞死亡。根據(jù)上述信息，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)要的實(shí)驗(yàn)方案從轉(zhuǎn)化的胚胎干細(xì)胞中篩選出正確整合的胚胎干細(xì)胞

用添加有G418、DHPG的培養(yǎng)液培養(yǎng)整合后的細(xì)胞，能存活的是正確整合的胚胎干細(xì)胞

用添加有G418、DHPG的培養(yǎng)液培養(yǎng)整合后的細(xì)胞，能存活的是正確整合的胚胎干細(xì)胞

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