銅綠假單胞菌常常引起禽類、水貂等發(fā)生敗血癥及呼吸系統(tǒng)感染等疾病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重?fù)p失?？蒲腥藛T嘗試克隆和表達(dá)該菌外膜蛋白o(hù)prD基因，以用于后期的疫苗研制工作。相關(guān)限制酶識別序列及用于構(gòu)建基因表達(dá)載體的質(zhì)粒圖示如圖，其中AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，請回答下列問題：

限制酶	識別序列
BamHⅠ	5'-G↓GATCC-3'
EcoRⅠ	5'-G↓AATTC-3'
NotⅠ	5'-GC↓GGCCGC-3
XhoⅠ	5'-C↓TCGAG-3'

（1）目的基因只有正確插入

啟動子和終止子

啟動子和終止子

之間才能正確表達(dá)。在表達(dá)載體中AmpR作為

標(biāo)記基因

標(biāo)記基因

。
（2）若已知銅綠假單胞菌的oprD基因序列，可利用PCR技術(shù)快速大量擴(kuò)增該基因，PCR 擴(kuò)增的原理是

DNA半保留復(fù)制

DNA半保留復(fù)制

，為使 PCR反應(yīng)體系中的模板解為單鏈，需要滿足的條件是

加熱（90℃以上）

加熱（90℃以上）

。為便于擴(kuò)增的oprD基因與表達(dá)載體的連接，在設(shè)計(jì)引物時，常在兩條引物的

5'

5'

端加上限制酶的識別序列，設(shè)計(jì)后的引物如下：
引物1：5′-CGGGATCCATGAAAGTGATGAAGTGG-3′
引物2：5′-CCCTCGAGTTACAGGATCGACAGCGG-3′
（3）根據(jù)上題中的引物信息分析，在構(gòu)建oprD基因表達(dá)載體時，可選擇

BamHⅠ

BamHⅠ

和

XhoⅠ

XhoⅠ

兩種不同的限制酶同時切割目的基因和質(zhì)粒，以提高目的基因和質(zhì)粒的重組效率。
（4）將基因表達(dá)載體與經(jīng)

Ca²⁺

Ca²⁺

處理 的處于感受態(tài)的受體菌細(xì)胞于緩沖液中混合，完成轉(zhuǎn)化過程。將完成轉(zhuǎn)化的受體菌接種在加有

氨芐青霉素

氨芐青霉素

的培養(yǎng)基上初步篩選后，再進(jìn)-步檢測、鑒定。