四尾柵藻生長周期短、適應(yīng)性強，是一種高潛力生物柴油新型原料，但油脂產(chǎn)量低。研究人員從含油量高的紫蘇中提取DGAT1（催化油脂合成的關(guān)鍵酶）基因，并成功導(dǎo)入到四尾柵藻細(xì)胞內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)油四尾柵藻。其制備流程如圖，圖中Amp^r表示氨芐青霉素抗性基因，LacZ基因可使細(xì)菌利用培養(yǎng)基中的物質(zhì)X-gal進(jìn)而使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，無該基因或該基因被破壞，菌落呈白色。回答下列問題：

（1）從高表達(dá)的紫蘇組織細(xì)胞中提取總的RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用于PCR擴(kuò)增。該過程獲得cDNA的原理是

在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對原則合成cDNA

在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對原則合成cDNA

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（2）PCR擴(kuò)增DGAT1基因時，使反應(yīng)體系中的模板cDNA解旋為單鏈的條件是

加熱至90～95℃

加熱至90～95℃

。在DNA延伸的過程中，使用砌酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是

Taq酶熱穩(wěn)定性高而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下失活

Taq酶熱穩(wěn)定性高而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下失活

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（3）構(gòu)建的pMD19-DGAT1導(dǎo)入到經(jīng)CaCl₂溶液處理的感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，并通過

稀釋涂布平板法

稀釋涂布平板法

（方法）接種到含

X-gal和氨芐青霉素

X-gal和氨芐青霉素

的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。一段時間后，挑選

白

白

色的菌落以提取質(zhì)粒pMD19-DGAT1。
（4）用限制酶BamHI和XbaI切割pMD19-DGAT1和pBI121，將其連接成重組表達(dá)載體pBI121-DGAT1，并將其導(dǎo)入四尾柵藻細(xì)胞中。與單酶切相比，雙酶切的優(yōu)點是

使DGAT1基因能定向插入表達(dá)載體，減少自身環(huán)化

使DGAT1基因能定向插入表達(dá)載體，減少自身環(huán)化

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