農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。植物基因工程中常用含有重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌和受體植物細胞的愈傷組織共培養(yǎng)，進行轉(zhuǎn)基因操作?，F(xiàn)有一段抗除草劑基因編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域在克隆載體上，要將其轉(zhuǎn)入棉花細胞，得到抗除草劑的轉(zhuǎn)基因棉花。
（1）在構(gòu)建基因表達載體的過程中，要先用

限制酶

限制酶

對

目的基因

目的基因

和

運載體

運載體

進行切割，之后用

DNA連接

DNA連接

酶連接形成重組質(zhì)粒。該過程中為保證目的基因以正確的方向與Ti質(zhì)粒進行連接，科學(xué)家使用

2

2

（填“1”或“2”）種限制酶。
（2）在以上重組質(zhì)粒中，目的基因和抗卡那霉素抗性基因，都應(yīng)該位于

T-DNA

T-DNA

片段內(nèi)，因為

Ti質(zhì)粒上只有T-DNA片段能夠整合到受體細胞的染色體DNA上

Ti質(zhì)粒上只有T-DNA片段能夠整合到受體細胞的染色體DNA上

。
（3）將重組的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌可用

Ca²⁺

Ca²⁺

處理。得到的農(nóng)桿菌菌液和棉花細胞愈傷組織共培養(yǎng)一段時間后，將愈傷組織置于含有

卡那霉素

卡那霉素

和除草劑的選擇培養(yǎng)基上進行組織培養(yǎng)，通過調(diào)整

生長素和細胞分裂素的比例

生長素和細胞分裂素的比例

，使其脫分化、再分化形成轉(zhuǎn)基因植株群體。
（4）除上述方法獲得抗除草劑的棉花，用物理或化學(xué)方法對大量正常棉花的

愈傷組織

愈傷組織

進行誘變處理，最終發(fā)現(xiàn)僅一株煙草（P）抗除草劑但同時花粉敗育。為保留抗除草劑特性，最快能在

F₁

F₁

（填“F₁”或“F₂”）中能獲得抗除草劑純合子植株。