煙草是有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的雙子葉植物，易受TMV（煙草花葉病毒）感染而大幅度減產(chǎn)。絞股藍(lán)細(xì)胞中含有抗TMV基因，能抵抗TMV感染。研究人員利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出了抗TMV的煙草，操作流程如圖所示?；卮鹣铝袉?wèn)題：

（1）過(guò)程①的產(chǎn)物可構(gòu)建

cDNA（或部分基因文庫(kù)）

cDNA（或部分基因文庫(kù)）

文庫(kù)，進(jìn)而獲得所需目的基因，該文庫(kù)不同于基因組文庫(kù)的特點(diǎn)有

文庫(kù)較小、基因中沒(méi)有啟動(dòng)子、基因中沒(méi)有內(nèi)含子、只含某種生物部分基因、全部基因可在物種間進(jìn)行交流

文庫(kù)較小、基因中沒(méi)有啟動(dòng)子、基因中沒(méi)有內(nèi)含子、只含某種生物部分基因、全部基因可在物種間進(jìn)行交流

（答出三點(diǎn)即可）。
（2）大量擴(kuò)增目的基因可以使用PCR技術(shù)，該技術(shù)包括變性、復(fù)性、延伸三個(gè)步驟，變性這一步驟的目的是

使DNA解旋（為單鏈）

使DNA解旋（為單鏈）

。
（3）在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，常用兩種不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，獲得不同的黏性末端，其主要目的是

防止目的基因或質(zhì)粒自身環(huán)化

防止目的基因或質(zhì)粒自身環(huán)化

。
（4）過(guò)程④最常用的方法是

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

。
（5）過(guò)程⑥還需要進(jìn)行基因工程操作步驟中的

目的基因的檢測(cè)與鑒定

目的基因的檢測(cè)與鑒定

，其中，在個(gè)體水平上檢驗(yàn)獲得的煙草是否抗TMV的方法是

用TMV感染煙草，觀察煙草是否被感染（或患病）

用TMV感染煙草，觀察煙草是否被感染（或患病）

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