酯酶結(jié)合熒光分析法可對有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行檢測，某研究院利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得一種催化效率高、農(nóng)藥敏感性強(qiáng)的微生物酯酶。

（1）人工合成酯酶基因后通過PCR技術(shù)可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，為該過程提供能量的是

dNTP

dNTP

；還需要設(shè)計(jì)兩種引物，設(shè)計(jì)引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的

3’端

3’端

開始連接脫氧核苷酸。為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，需要在引物的5’端設(shè)計(jì)

HindⅢ、EcoRⅠ

HindⅢ、EcoRⅠ

酶的識(shí)別序列。某質(zhì)粒圖譜和目的基因的序列如圖所示，應(yīng)選擇引物

①③

①③

（填數(shù)字）。（①-④中加粗表示識(shí)別序列前的保護(hù)堿基，增強(qiáng)上述酶與目的基因的結(jié)合）
①5′-CCGGAATTCATGCTTGATATGCCAATC-3′
②5′-CCCAAGCTTATGCTTGATATGCCAATC-3′
③5′-CCCAAGCTTCTAGTCGAACACAAGAAG-3′
④5′-CCGGAATTCCTAGTCGAACACAAGAAG-3′
（2）若提取高產(chǎn)酯酶野生菌的基因組DNA，用設(shè)計(jì)的引物和合適的條件進(jìn)行PCR，其產(chǎn)物可用

電泳

電泳

鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有目的基因以外的雜帶存在，分析可能原因是：

在基因組DNA中有其他引物結(jié)合的位點(diǎn)/引物特異性不強(qiáng)/引物過短

在基因組DNA中有其他引物結(jié)合的位點(diǎn)/引物特異性不強(qiáng)/引物過短

。解決措施：在目的基因的

上、下游

上、下游

（填“內(nèi)部”或“上、下游”）重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR。

限制酶	識(shí)別序列與切割位點(diǎn)	限制酶	識(shí)別序列與切割位點(diǎn)
PstⅠ	5′-CTGCA↓G-3′	NdeⅡ	5′-↓GATC-3′
HindⅢ	5′-A↓AGCTT-3′	EcoRⅠ	5′-G↓AATTC-3′
DpnⅡ	5′-↓GATC-3′	AluⅠ	5′-AG↓CT-3′

（3）將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒用限制酶酶切，酶切產(chǎn)物純化后，用

DNA連接酶

DNA連接酶

連接，連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌前需用

Ca²⁺（氯化鈣溶液）

Ca²⁺（氯化鈣溶液）

處理大腸桿菌，使其處于感受態(tài)。
（4）將目的蛋白與某些標(biāo)簽融合表達(dá)形成含標(biāo)簽的融合蛋白，實(shí)現(xiàn)增溶、防降解、促進(jìn)分泌、便于純化和檢測等功能。6×His-Tag（組氨酸標(biāo)簽）含有的咪唑基團(tuán)選擇性地結(jié)合在已固定于層析介質(zhì)的Ni²⁺、Co²⁺等金屬離子上。高濃度的咪唑緩沖液可以競爭性洗脫結(jié)合在介質(zhì)上的His標(biāo)簽蛋白。據(jù)此推測，6×His-Tag的作用之一是

便于純化目的蛋白

便于純化目的蛋白

。