表皮生長因子受體（EGFR）是原癌基因表達的產(chǎn)物。EGFR由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)三部分組成，EGFR與其配體結(jié)合后能引起一系列基因活化，導致腫瘤細胞增殖。DNEGFR基因是EGFR基因缺失了胞內(nèi)區(qū)的突變基因，科研人員研究了DNEGFR基因表達和定位情況，流程如圖1，請回答：
?
（1）從人結(jié)腸癌組織中提取總RNA，經(jīng)

逆轉(zhuǎn)錄

逆轉(zhuǎn)錄

過程合成cDNA．根據(jù)人EGFR前體cDNA的序列設計合成引物，擴增得到DNEGFRcDNA，其表達產(chǎn)物因缺失胞內(nèi)區(qū)而沒有信號轉(zhuǎn)導功能，但其能夠與

EGFR

EGFR

競爭結(jié)合配體，從而達到抑制腫瘤細胞增殖的作用。
（2）RT-PCR過程所用引物如下，據(jù)圖可知，構(gòu)建重組質(zhì)粒時使用的兩種限制酶是

NheⅠ和SacⅡ

NheⅠ和SacⅡ

。研究人員將DNEGFR和EGFP融合在一起的目的是

借助EGFP基因的達產(chǎn)物來鑒定篩選成功導入DNEGFR基因的受體細胞，并以EGFP的位置來進行DNEGFR的亞細胞結(jié)構(gòu)定位

借助EGFP基因的達產(chǎn)物來鑒定篩選成功導入DNEGFR基因的受體細胞，并以EGFP的位置來進行DNEGFR的亞細胞結(jié)構(gòu)定位

。
5'-AAAAGCTAGCACCATGCGACCCTCCGGAC-3'
3'-TAATCCGCGTACGTACCGCATGAAGAGGCCGATCCC-5'
（3）本實驗將EGFP序列融合在DNEGFR序列的下游而不是上游，原因是若將EGFP序列放在上游，

①②

①②

。
①DNEGFR基因表達的前體蛋白的信號肽段不能發(fā)揮定位作用
②會影響配體與胞外區(qū)的結(jié)合
③會影響 EGFP 基因的表達
④會影響質(zhì)粒的復制
（4）向感受態(tài)細菌懸浮液中加入重組質(zhì)?；靹?。擴大培養(yǎng)后取菌液涂布于卡那霉素篩選LB平板上，37℃正向放置0.5h,正向放置0.5h的目的是

使重組質(zhì)粒進入感受態(tài)細菌

使重組質(zhì)粒進入感受態(tài)細菌

，然后倒置平皿37℃培養(yǎng)12～16h。挑選菌落分別擴增、鑒定，待鑒定正確后大量提取質(zhì)粒。
（5）將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-DNEGFR包裹到主要由

磷脂雙分子層

磷脂雙分子層

構(gòu)成的脂質(zhì)體內(nèi)，與動物細胞發(fā)生融合，重組質(zhì)粒最終發(fā)生轉(zhuǎn)化。72h后再利用光譜激光掃描共聚焦顯微鏡觀測結(jié)果見圖2A，檢測表明融合蛋白成功錨定于

細胞膜

細胞膜

，細胞質(zhì)存在少量熒光的原因可能是

信號肽段在翻譯后加工時被裂解，或轉(zhuǎn)入感受態(tài)細菌的是質(zhì)粒pEGFP-N1

信號肽段在翻譯后加工時被裂解，或轉(zhuǎn)入感受態(tài)細菌的是質(zhì)粒pEGFP-N1

。為了讓結(jié)果更加嚴謹，設置B、C兩組對照，推測 B組的處理方式是

含pEGFP-N1的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細胞

含pEGFP-N1的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細胞

。