24.已知組成型啟動(dòng)子可以高效地啟動(dòng)目的基因在植物各種組織中的表達(dá),但常會(huì)阻礙植物的生長(zhǎng)發(fā)育。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可在特定環(huán)境條件下誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。沙冬青脫水素基因(AmDHN基因)能使植株具有較強(qiáng)的抗旱作用。科研人員通過(guò)構(gòu)建AmDHN基因表達(dá)載體,以培育耐旱苜蓿新品種,所用載體如圖1所示,請(qǐng)回答下列問(wèn)題:
限制酶 |
Be1Ⅰ |
SacⅠ |
BamHⅠ |
PstⅠ |
SmaⅠ |
識(shí)別序列和酶切位點(diǎn) |
T↓GATCA |
GAGCT↓C |
G↓GATCC |
CTGCA↓G |
CCC↓GGG |
(1)用載體1構(gòu)建含AmDHN目的基因的表達(dá)載體,可以成功轉(zhuǎn)化苜蓿,但會(huì)出現(xiàn)抑制抗性芽生長(zhǎng)和抗性植株生根的現(xiàn)象,推測(cè)
35S啟動(dòng)子屬于
啟動(dòng)子。
(2)如表是科研人員擴(kuò)增Rd29A啟動(dòng)子所設(shè)計(jì)的引物,根據(jù)引物的堿基序列及限制酶的識(shí)別序列分析,構(gòu)建載體2時(shí)選用的限制酶是
。為了改造載體1中的啟動(dòng)子,需要用
酶切割載體1、2為最佳。
上游引物P1:5'-GACCCGGGTTTCCAAAGATTTTTTTC-3' 下游引物P2:5'-GAGAGCTCTGGGGTTTTGCTTTTGAATGT-3' |
(3)構(gòu)建Rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)AmDHN基因的表達(dá)載體后,先將其導(dǎo)入
,再轉(zhuǎn)化苜蓿。轉(zhuǎn)化后應(yīng)在培養(yǎng)基中添加
進(jìn)行篩選。
(4)為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因苜蓿中AmDHN基因的表達(dá)水平,科研人員做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。如表呈現(xiàn)了部分操作步驟,請(qǐng)完成表格:
實(shí)驗(yàn)步驟的目的 |
簡(jiǎn)要操作過(guò)程 |
① |
在轉(zhuǎn)基因無(wú)菌苗根系長(zhǎng)至 2~3 cm 時(shí),將培養(yǎng)無(wú)菌苗三角瓶的封口膜打開(kāi),培養(yǎng)一周,觀察其生長(zhǎng)狀況 |
提供適宜生長(zhǎng)條件 |
將甲組幼苗根系置于300mL水中 |
模擬干旱脅迫條件 |
② |
無(wú)關(guān)變量控制 |
將甲、乙兩組置于溫度、光照等條件適宜且相同的環(huán)境中培養(yǎng)8h,之后剪取兩組葉片放在液氮中儲(chǔ)存 |
③ |
對(duì)葉片研磨、離心后,提取④ ,以AmDHN和MtActin基因⑤ 為依據(jù)設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,其中MtActin(一種細(xì)胞骨架蛋白)為內(nèi)參。擴(kuò)增產(chǎn)物用⑥ 檢測(cè),EB(溴化乙錠)染色照相如圖。
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