22．p53基因是一種抑癌基因，在惡性腫瘤患者中突變率達50%以上。與人相比，大象體內(nèi)含有多對p53基因，推測是其很少患腫瘤的主要原因。設(shè)計實驗探究人p53基因在乳腺腫瘤細胞中的作用，回答下列問題：
（1）利用PCR技術(shù)擴增p53基因。首先根據(jù)p53基因的核苷酸序列，設(shè)計并合成
，其能與變性p53基因單鏈結(jié)合，在
催化作用下延伸，如此循環(huán)多次。
（2）p53基因表達載體的構(gòu)建。如圖所示，表達載體上除了標注的DNA片段外，在p53基因上游還必須擁有的DNA片段（箭頭所示）是
，其作用機理是
。外源p53基因插入載體中至少需要兩種工具酶，包括準確切割DNA的限制性核酸內(nèi)切酶和將雙鏈DNA片段“縫合”起來的
。
（3）乳腺腫瘤細胞培養(yǎng)。完成倫理學(xué)審查和病人知情同意書簽署后，將患者乳腺腫瘤組織塊剪碎，制成細胞懸液在適宜的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境中所需的主要氣體包括細胞代謝必需的
和維持培養(yǎng)液pH值的
。保持培養(yǎng)環(huán)境處于無菌無毒條件的操作包括
（答出兩點即可）。
（4）檢測p53基因表達對乳腺腫瘤細胞增殖的影響。分別將空載體和p53表達載體轉(zhuǎn)入腫瘤細胞培養(yǎng)，采用特殊方法檢測細胞增殖情況，并從培養(yǎng)的腫瘤細胞中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的
進行雜交，檢測p53基因翻譯成蛋白質(zhì)的情況，探索雜交帶強度與細胞增殖率相關(guān)性。
