12.圖示PIJ702是一種常用質(zhì)粒,其中tar為硫鏈絲菌素(一種抗生素)抗性基因;mel為黑色素合成基因,其表達(dá)能使白色的鏈霉菌菌落變成黑色菌落;而三種限制酶SacⅠ、SphⅠ、BglⅡ在pIJ702上分別只有一處識(shí)別序列。回答下列問題。
表1
pU702pZHZ8 |
BglI5.7kb6.7kb |
表2
固體培養(yǎng)基中硫鏈絲菌素濃度(ug/mL) |
0 |
1 |
2 |
5 |
10 |
不含質(zhì)粒的鏈霉菌生長狀況 |
+++++ |
+++ |
+ |
- |
- |
+表示生長;-表示不生長。
(1)限制性核酸內(nèi)切酶可以識(shí)別雙鏈DNA中特定核苷酸序列,并使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的
斷裂,切割形成的末端有
兩種。
(2)以SacⅠ和SphⅠ切取目的基因,與質(zhì)粒pIJ702上長度為0.4kb的SacⅠ/SphⅠ片段進(jìn)行置換,構(gòu)建重組質(zhì)粒pZHZ8。上述兩種質(zhì)粒經(jīng)限制酶BglⅡ酶切后所得片段長度見表1。由此判斷目的基因的片段長度為
kb,判定目的基因中含有一個(gè)BglⅡ切割位點(diǎn)的理由是
。
(3)導(dǎo)入目的基因時(shí),首先用Ca
2+處理鏈霉菌使其成為感受態(tài)細(xì)胞,再將重組質(zhì)粒pZHZ8溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合,在一定的溫度下可以促進(jìn)鏈霉菌完成
過程。
(4)不含質(zhì)粒的鏈霉菌在含硫鏈絲菌素的固體培養(yǎng)基上生長狀況如表2所示。若要篩選導(dǎo)入pZHZ8的鏈霉菌細(xì)胞,所需硫鏈絲菌素濃度至少應(yīng)在
μg/mL以上,挑選成功導(dǎo)入pZHZ8的鏈霉菌的具體方法是
。若要檢測整合到染色體DNA上的目的基因是否發(fā)揮功能作用,第一步需檢測受體細(xì)胞的
(填“DNA”或“RNA”),檢測方法應(yīng)采用
技術(shù)。