44．角蛋白酶（KerA）是降解角蛋白的酶類(lèi)，在飼料工業(yè)中具有較大的應(yīng)用前景，但天然菌株產(chǎn)酶量低限制了其推廣應(yīng)用。為了獲得高效表達(dá)的KerA工程菌，研究者分別構(gòu)建了大腸桿菌和畢赤酵母工程菌，并實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。圖1為含KerA基因的外源DNA、質(zhì)粒的有關(guān)信息，EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、XhoⅠ均為限制酶，Kan
r、Tc
r分別為卡那霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因。請(qǐng)回答下列相關(guān)問(wèn)題：
（1）為了獲取KerA基因，從天然菌株中提取相應(yīng)的DNA片段，再通過(guò)PCR技術(shù)大量擴(kuò)增，PCR技術(shù)的原理
，前提是
。
（2）為了形成合適的重組質(zhì)粒，應(yīng)該選用
和
限制酶切割外源DNA和質(zhì)粒DNA。
（3）重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞的成功率很低，需經(jīng)篩選才能獲得導(dǎo)入成功的受體細(xì)胞。結(jié)合圖1所獲得的重組質(zhì)粒分析，應(yīng)選擇具有
特點(diǎn)的細(xì)胞作為受體細(xì)胞，才有利于后續(xù)的篩選。
（4）將目的基因?qū)氪竽c桿菌時(shí)，常出現(xiàn)三種情況：未轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、含空載體（普通質(zhì)粒）的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌。圖2是KerA基因重組質(zhì)粒的“工程菌”的篩選示意圖：圖中的
和
（選用“A/B/C/D/E”字母作答）菌落為含有目的基因的“工程菌”。
（5）KerA基因在大腸桿菌和畢赤酵母工程菌是否能實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，需要用
技術(shù)檢測(cè)，若在二者細(xì)胞中都能實(shí)現(xiàn)表達(dá)，從分子水平上分析原因是
，并且它們體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的過(guò)程或機(jī)制相同。但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，只有畢赤酵母工程菌表達(dá)合成的KerA可直接投入使用，分析其原因是
。
（6）KerA在60℃以上時(shí)熱穩(wěn)定性差，限制了該酶的應(yīng)用范圍，研究人員在KerA的末端插入半胱氨酸，這不僅對(duì)酶活性影響小，且大大提高了其熱穩(wěn)定性。其運(yùn)用到的這種現(xiàn)代生物技術(shù)為
。
