角蛋白酶（KerA）是降解角蛋白的酶類，在飼料工業(yè)中具有較大的應用前景，但天然菌株產酶量低限制了其推廣應用。為了獲得高效表達的KerA工程菌，研究者分別構建了大腸桿菌和畢赤酵母工程菌，并實現(xiàn)了異源表達。圖1為含KerA基因的外源DNA、質粒的有關信息，EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、XhoⅠ均為限制酶，Kan^r、Tc^r分別為卡那霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因。請回答下列相關問題：
（1）為了獲取KerA基因，從天然菌株中提取相應的DNA片段，再通過PCR技術大量擴增，PCR技術的原理

DNA雙鏈復制

DNA雙鏈復制

，前提是

要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物

要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物

。
（2）為了形成合適的重組質粒，應該選用

BamHⅠ

BamHⅠ

和

XhoⅠ

XhoⅠ

限制酶切割外源DNA和質粒DNA。

（3）重組質粒導入受體細胞的成功率很低，需經篩選才能獲得導入成功的受體細胞。結合圖1所獲得的重組質粒分析，應選擇具有

在卡那霉素的培養(yǎng)基上不能生長（在四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長不生長）

在卡那霉素的培養(yǎng)基上不能生長（在四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長不生長）

特點的細胞作為受體細胞，才有利于后續(xù)的篩選。
（4）將目的基因導入大腸桿菌時，常出現(xiàn)三種情況：未轉化的細菌、含空載體（普通質粒）的細菌、含重組質粒的細菌。圖2是KerA基因重組質粒的“工程菌”的篩選示意圖：圖中的

B

B

和

D

D

（選用“A/B/C/D/E”字母作答）菌落為含有目的基因的“工程菌”。
（5）KerA基因在大腸桿菌和畢赤酵母工程菌是否能實現(xiàn)異源表達，需要用

抗原-抗體雜交

抗原-抗體雜交

技術檢測，若在二者細胞中都能實現(xiàn)表達，從分子水平上分析原因是

抗原-抗體雜交技術 共用一套遺傳密碼

抗原-抗體雜交技術 共用一套遺傳密碼

，并且它們體內轉錄和翻譯的過程或機制相同。但經研究發(fā)現(xiàn)，只有畢赤酵母工程菌表達合成的KerA可直接投入使用，分析其原因是

畢赤酵母是具有內質網、高爾基體的真核生物，而大腸桿菌則沒有，前者能將翻譯出來的KerA肽鏈加工成具有活性（或空間結構）的蛋白質

畢赤酵母是具有內質網、高爾基體的真核生物，而大腸桿菌則沒有，前者能將翻譯出來的KerA肽鏈加工成具有活性（或空間結構）的蛋白質

。
（6）KerA在60℃以上時熱穩(wěn)定性差，限制了該酶的應用范圍，研究人員在KerA的末端插入半胱氨酸，這不僅對酶活性影響小，且大大提高了其熱穩(wěn)定性。其運用到的這種現(xiàn)代生物技術為

蛋白質工程

蛋白質工程

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