角蛋白酶（KerA）是降解角蛋白的酶類(lèi)，在飼料工業(yè)中具有較大的應(yīng)用前景，但天然菌株產(chǎn)酶量低限制了其推廣應(yīng)用。為了獲得高效表達(dá)的KerA工程菌，研究者分別構(gòu)建了大腸桿菌和畢赤酵母工程菌，并實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。圖1為含KerA基因的外源DNA、質(zhì)粒的有關(guān)信息，EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、XhoⅠ均為限制酶，Kanr、Tcr分別為卡那霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因。請(qǐng)回答下列相關(guān)問(wèn)題：
（1）為了獲取KerA基因，從天然菌株中提取相應(yīng)的DNA片段，再通過(guò)PCR技術(shù)大量擴(kuò)增，PCR技術(shù)的原理
DNA雙鏈復(fù)制
DNA雙鏈復(fù)制
，前提是 要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物
要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物
。
（2）為了形成合適的重組質(zhì)粒，應(yīng)該選用 BamHⅠ
BamHⅠ
和 XhoⅠ
XhoⅠ
限制酶切割外源DNA和質(zhì)粒DNA。
（3）重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞的成功率很低，需經(jīng)篩選才能獲得導(dǎo)入成功的受體細(xì)胞。結(jié)合圖1所獲得的重組質(zhì)粒分析，應(yīng)選擇具有 在卡那霉素的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)（在四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不生長(zhǎng)）
在卡那霉素的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)（在四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不生長(zhǎng)）
特點(diǎn)的細(xì)胞作為受體細(xì)胞，才有利于后續(xù)的篩選。
（4）將目的基因?qū)氪竽c桿菌時(shí)，常出現(xiàn)三種情況：未轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、含空載體（普通質(zhì)粒）的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌。圖2是KerA基因重組質(zhì)粒的“工程菌”的篩選示意圖：圖中的 B
B
和 D
D
（選用“A/B/C/D/E”字母作答）菌落為含有目的基因的“工程菌”。
（5）KerA基因在大腸桿菌和畢赤酵母工程菌是否能實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，需要用抗原-抗體雜交
抗原-抗體雜交
技術(shù)檢測(cè)，若在二者細(xì)胞中都能實(shí)現(xiàn)表達(dá)，從分子水平上分析原因是 抗原-抗體雜交技術(shù) 共用一套遺傳密碼
抗原-抗體雜交技術(shù) 共用一套遺傳密碼
，并且它們體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的過(guò)程或機(jī)制相同。但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，只有畢赤酵母工程菌表達(dá)合成的KerA可直接投入使用，分析其原因是 畢赤酵母是具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的真核生物，而大腸桿菌則沒(méi)有，前者能將翻譯出來(lái)的KerA肽鏈加工成具有活性（或空間結(jié)構(gòu)）的蛋白質(zhì)
畢赤酵母是具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的真核生物，而大腸桿菌則沒(méi)有，前者能將翻譯出來(lái)的KerA肽鏈加工成具有活性（或空間結(jié)構(gòu)）的蛋白質(zhì)
。
（6）KerA在60℃以上時(shí)熱穩(wěn)定性差，限制了該酶的應(yīng)用范圍，研究人員在KerA的末端插入半胱氨酸，這不僅對(duì)酶活性影響小，且大大提高了其熱穩(wěn)定性。其運(yùn)用到的這種現(xiàn)代生物技術(shù)為 蛋白質(zhì)工程
蛋白質(zhì)工程
。
