24．腦心肌炎病毒（EMCV，RNA病毒）是引起人、豬腦炎和心肌炎的病原體。為研制疫苗，科研人員按如圖流程培育轉(zhuǎn)基因酵母菌，來生產(chǎn)EMCV的衣殼蛋白VP1。其中，受體酵母菌是組氨酸合成缺陷型，HIS4基因表達的酶催化組氨酸的合成，C418是一種抗生素。請回答下列問題：
| 限制酶 |
EcoRⅠ |
NotⅠ |
SalⅠ |
| 識別序列和切割位點 |
G↓AATTC |
GC↓GGCCGC |
G↓TCGAC |
（1）過程①通過RT?PCR獲得目的基因，下列3種引物中，過程①應(yīng)選擇的是
。
a.5′?GGAATTCGCCACCATGGGAGTGGAAAACGCTGAA?3′
b.5′?TCGTCGACCATCGATAGCCACTGGCCTAACGCC?3′
c.5′?ATTTGCGGCCGCTCACTCTAGCATCAAGACT?3′
（2）PCR技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，可用于擴增目的基因，制作探針，引入定點突變，定量檢測DNA等。完成下列有關(guān)PCR技術(shù)和相關(guān)應(yīng)用的問題：
①PCR過程中，溫度的控制至關(guān)重要，變性溫度過低會因為
，最終都會導(dǎo)致反應(yīng)效率降低。退火溫度過高則會因
導(dǎo)致目標產(chǎn)物的量減少。
②不對稱PCR是利用不等量的一對引物來產(chǎn)生大量單鏈DNA的方法。這兩種引物分別為限制性引物與非限制性引物，其最佳比例一般為1：50～1：100，在PCR反應(yīng)的最初10～15個循環(huán)中，其擴增產(chǎn)物最初主要是雙鏈DNA，但當限制性引物消耗完后，非限制性引物引導(dǎo)的PCR就會產(chǎn)生大量的單鏈DNA。假設(shè)反應(yīng)體系中原來有a個模板DNA，最初10個循環(huán)擴增產(chǎn)生雙鏈DNA，后20個循環(huán)均只擴增一條鏈，則需要限制性引物
個。因為雙鏈DNA和單鏈DNA的
不同，可通過
將其分離。
（3）過程③將質(zhì)粒2導(dǎo)入大腸桿菌的目的是
。
（4）過程⑤將質(zhì)粒2線性化時使用的是
（限制酶），過程⑥線性DNA需整合到酵母細胞的染色體DNA中目的基因才能
。
（5）線性DNA整合到酵母細胞染色體DNA時，可能是單拷貝整合，也可能是多拷貝整合。過程⑦先將酵母菌培養(yǎng)在缺乏
的培養(yǎng)基中，篩選獲得導(dǎo)入目的基因的酵母菌；后將篩選出的酵母菌接種于含2mg?L
-1G418的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，選擇生長良好的酵母菌再轉(zhuǎn)接到含4mg?L
-1G418的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，其目的是
。
（6）研究人員用兔抗EMCV血清與酵母細胞生產(chǎn)的VP1蛋白進行抗原?抗體免疫反應(yīng)試驗，其目的是
。
