大麗輪枝菌（一種絲狀真菌）是引起棉花黃萎病的主要病原菌。為觀察大麗輪枝菌對棉花根侵染路徑，研究人員利用綠色熒光蛋白基因（sGFP）轉(zhuǎn)染大麗輪枝菌，培育出表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因菌株，主要過程如圖（圖中a鏈和b鏈分別是相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄模板鏈）。分析回答：

（1）過程①中，PCR擴(kuò)增sGFP的原理是

DNA分子復(fù)制

DNA分子復(fù)制

，該過程除需要根據(jù)

sGFP兩端的堿基序列

sGFP兩端的堿基序列

設(shè)計(jì)特異性引物序列外，為保證sCFP正確插入到質(zhì)粒中，還需要在引物的 5ˊ端添加限制酶識別序列，圖中b鏈的黏性末端堿基序列（5ˊ→3ˊ）為

AGCT

AGCT

。
（2）過程①中，除了要添加模板、引物、原料外，還需添加

Taq

Taq

酶。若1個(gè)sGFP片段連續(xù)擴(kuò)增4次，則會形成

8

8

個(gè)兩條鏈等長的sGFP片段，消耗

7

7

個(gè)引物1。
（3）過程②需要的工具酶是

DNA連接酶

DNA連接酶

。研究中將 sGFP 插入到構(gòu)巢曲霉啟動子和終止子之間的目的是

保證sGFP基因可以在大麗輪枝菌細(xì)胞中表達(dá)

保證sGFP基因可以在大麗輪枝菌細(xì)胞中表達(dá)

。
（4）將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌時(shí)，需要用

Ca²⁺（ CaCl₂）

Ca²⁺（ CaCl₂）

處理農(nóng)桿菌，使其轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細(xì)胞。
（5）過程③中需要配制細(xì)菌培養(yǎng)基，配制時(shí)要在培養(yǎng)基滅菌并冷卻到 80℃左右后，再加入用潮霉素溶液，潮霉素不能與培養(yǎng)基一同滅菌的原因是

潮霉素在高溫滅菌時(shí)結(jié)構(gòu)會被破壞

潮霉素在高溫滅菌時(shí)結(jié)構(gòu)會被破壞

。
（6）選擇過程③篩選培養(yǎng)得到的不同農(nóng)桿菌菌落，分別提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA，并用BamHI和 HindIII完全酶切可以得到

3

3

種長度不同的DNA片段。
（7）將導(dǎo)入重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌加入大麗輪枝菌的孢子細(xì)胞懸液中，在適宜條件完成轉(zhuǎn)  染后利用濾膜過濾得到孢子細(xì)胞，再在真菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得菌落，最終通過檢測

大麗輪枝菌細(xì)胞中綠色熒光的強(qiáng)度

大麗輪枝菌細(xì)胞中綠色熒光的強(qiáng)度

篩選出綠色熒光蛋白旺盛表達(dá)的大麗輪枝菌。