四環(huán)素被廣泛應(yīng)用于治療人及動物的細菌感染,但殘留在動物組織、奶制品中的四環(huán)素通過食物鏈進入人體,會對人類健康造成威脅。為保障食品安全和人類健康,科研人員向大腸桿菌體內(nèi)導(dǎo)入了一些特殊的DNA序列作為生物傳感器,從而建立一種簡易、靈敏以及準確的四環(huán)素檢測方法。
(1)研究者利用圖1所示的原理設(shè)計四環(huán)素檢測傳感器。
當環(huán)境中沒有四環(huán)素時,GFP(綠色熒光蛋白)基因
不表達
不表達
。當環(huán)境中有四環(huán)素時,四環(huán)素能夠解除
R蛋白對啟動子B的抑制作用
R蛋白對啟動子B的抑制作用
,最終使菌體
發(fā)出綠色熒光
發(fā)出綠色熒光
。因此可以通過檢測熒光強弱來判定環(huán)境中的四環(huán)素濃度。
(2)研究者利用基因工程技術(shù)構(gòu)建含四環(huán)素檢測傳感器的大腸桿菌工程菌。
①利用圖2所示的質(zhì)粒1和質(zhì)粒2,構(gòu)建同時含片段1和片段2的表達載體,可用限制酶
E、X
E、X
和
E、S
E、S
分別處理質(zhì)粒1和質(zhì)粒2,再用DNA連接酶連接。(四種限制酶的識別序列及切割位點如表所示)
限制酶 |
E |
X |
S |
P |
識別序列及切割位點 |
5′…G↓AATTC…3′ 3′…CTTAA↑G…5′ |
5′…T↓CTAGA…3′ 3′…AGATC↑T…5′ |
5′…A↓CTAGT…3′ 3′…TGATC↑A…5′ |
5′…CTGCA↓G…3′ 3′…G↑ACGTC…5′ |
②研究者通過上述方法將所有的啟動子和相應(yīng)基因的DNA片段與載體連接,構(gòu)建表達載體,導(dǎo)入用
CaCl2
CaCl2
處理的大腸桿菌細胞內(nèi)。經(jīng)過篩選,獲得工程菌。
(3)研究者發(fā)現(xiàn)在四環(huán)素濃度較低時,隨四環(huán)素濃度增加,工程菌的熒光強度變化不明顯。欲獲得檢測靈敏度更高的傳感器,從以下選項中選擇啟動子和基因,構(gòu)建表達載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌后篩選。請從方案一、二中選擇最合適的一種方案,將所選序號填入橫線上
①A②C③D
①A②C③D
。
Ⅰ.啟動子:
①啟動子A
②啟動子B
③經(jīng)T7RNA聚合酶特異性誘導(dǎo)開啟的啟動子
Ⅱ.基因:
A:R基因
B:GFP基因
C:T7基因(表達T7RNA聚合酶,其活性比大腸桿菌RNA聚合酶更高)
D:sfGFP基因(表達熒光強度和穩(wěn)定性都高于GFP的綠色熒光蛋白)