為了研究低溫誘導(dǎo)對某基因的啟動子P活性的影響,科研人員進行了啟動子P的PCR提取、特定表達載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因煙草的功能鑒定。該基因及其啟動子P的結(jié)構(gòu)及相應(yīng)限制酶的切割位點如圖1所示,圖中灰色區(qū)域堿基序列是已知的,啟動子P(圖中黑色區(qū)域)及上游堿基序列未知,片段Ⅰ和片段Ⅱ中的字母A~F均表示引物。請回答下列問題。
(1)啟動子是
RNA聚合酶識別并結(jié)合
RNA聚合酶識別并結(jié)合
的位點。不能直接根據(jù)片段I擴增啟動子P的原因是
啟動子P及左側(cè)的序列未知,無法合成PCR所需要的引物
啟動子P及左側(cè)的序列未知,無法合成PCR所需要的引物
。
(2)為了能擴增正常啟動子P,科研人員先用
酶1和DNA連接
酶1和DNA連接
酶處理圖中的片段Ⅰ,使片段Ⅰ成為環(huán)狀DNA;再將環(huán)狀DNA用
酶2
酶2
(填“酶1”或“酶2”)處理得到了片段Ⅱ,如圖2所示。根據(jù)片段Ⅱ能不能擴增出啟動子P?若能,請寫出可選用的引物組合(用C、D、E、F表示),若不能請說明理由
能,可選用的引物組合是D和E
能,可選用的引物組合是D和E
。
(3)已知卡那霉素可抑制煙草細胞的生長,基因M可在煙草的根部正常表達,其表達產(chǎn)物可將X-Gluc水解生成藍色物質(zhì)。將啟動子P和基因M結(jié)合并與含有卡那霉素抗性基因的Ti-質(zhì)粒重組構(gòu)建基因表達載體。將表達載體和酚類物質(zhì)混合后加入含有煙草細胞的培養(yǎng)基中,酚類物質(zhì)的作用是
吸引農(nóng)桿菌感染煙草細胞
吸引農(nóng)桿菌感染煙草細胞
。再用含有
卡那霉素和X?Gluc
卡那霉素和X?Gluc
的培養(yǎng)基篩選出所需的煙草細胞,然后經(jīng)過植物組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。