酯酶結(jié)合熒光分析法可對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)，某研究院利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得一種催化效率高、農(nóng)藥敏感性強(qiáng)的微生物酯酶。
| 限制酶 |
識(shí)別序列與切割位點(diǎn) |
限制酶 |
識(shí)別序列與切割位點(diǎn) |
| PstⅠ |
5'-CTGCA↓G-3' |
NdeⅡ |
5'-↓GATC-3' |
| HindⅢ |
5'-A↓AGCTT-3' |
EcoRⅠ |
5'-G↓GAATC-3' |
| DpnⅡ |
5'-↓GATC-3' |
AluⅠ |
5'-AG↓CT-3' |
（1）人工合成酯酶基因后通過 PCR 技術(shù)可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，為該過程提供能量的是
4種dNTP
4種dNTP
；還需要設(shè)計(jì)兩種引物，設(shè)計(jì)引物的作用是使 DNA 聚合酶能夠從引物的
3’端
3’端
開始連接脫氧核苷酸為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，需要在引物的5′端設(shè)計(jì)
限制（性內(nèi)切核酸）
限制（性內(nèi)切核酸）
酶的識(shí)別序列。某質(zhì)粒圖譜和目的基因的序列如圖1所示，應(yīng)選擇引物
①③
①③
（填數(shù)字）。（①-④中加粗表示識(shí)別序列前的保護(hù)堿基，增強(qiáng)上述酶與目的基因的結(jié)合。）
①5’-CCGGAATTCATGCTTGATATGCCAATC-3’
②5’-CCCAAGCTTATGCTTGATATGCCAATC-3’
③5’-CCCAAGCTTCTAGTCGAACACAAGAAG-3’
④5’-CCGGAATTCCTAGTCGAACACAAGAAG-3’
（2）若提取高產(chǎn)酯酶野生菌的基因組DNA，用設(shè)計(jì)的引物和合適的條件進(jìn)行PCR，其產(chǎn)物可用
（瓊脂糖凝膠）電泳
（瓊脂糖凝膠）電泳
鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有目的基因以外的雜帶存在，分析可能原因是：
在基因組DNA中有其他引物結(jié)合的位點(diǎn)/引物特異性不強(qiáng)/引物過短
在基因組DNA中有其他引物結(jié)合的位點(diǎn)/引物特異性不強(qiáng)/引物過短
。解決措施：在目的基因的
上、下游
上、下游
（填“內(nèi)部”或“上、下游”） 重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行 PCR。
（3）將 PCR 產(chǎn)物和質(zhì)粒用限制酶酶切，酶切產(chǎn)物純化后，用
DNA連接酶
DNA連接酶
連接，連接產(chǎn)物導(dǎo)入大 腸桿菌前需用
Ca2+（氯化鈣溶液）
Ca2+（氯化鈣溶液）
處理大腸桿菌，使其處于感受態(tài)。
（4）將目的蛋白與某些標(biāo)簽融合表達(dá)形成含標(biāo)簽的融合蛋白，實(shí)現(xiàn)增溶、防降解、促進(jìn)分泌、便于純化和檢測(cè)等功能。6×His-Tag（組氨酸標(biāo)簽）含有的咪唑基團(tuán)選擇性地結(jié)合在已固定于層析 介質(zhì)的 Ni
2+、Co
2+等金屬離子上。高濃度的咪唑緩沖液可以競(jìng)爭(zhēng)性洗脫結(jié)合在介質(zhì)上的 His 標(biāo)簽 蛋白。據(jù)此推測(cè)，6×His-Tag 的作用之一是
便于純化目的蛋白
便于純化目的蛋白
。
