為研究干旱脅迫基因LEA和VOC對甘藍(lán)型油菜油脂的積累機(jī)制,科研人員構(gòu)建了兩個基因表達(dá)載體。其中基因LEA與熒光素酶基因(Luc)構(gòu)建成基因表達(dá)載體甲,基因VOC和標(biāo)記基因構(gòu)建成基因表達(dá)載體乙,相關(guān)序列及酶切位點如圖1所示。
(1)利用PCR擴(kuò)增LEA基因時,需要在引物的
5′端
5′端
(填“3′端”或“5′端”)添加限制酶識別序列,添加序列對應(yīng)的限制酶是
EcoRⅤ和XbaⅠ
EcoRⅤ和XbaⅠ
,選擇上述酶的依據(jù)是
Luc中存在BamHⅠ識別序列,BamHⅠ會將Luc切斷;一種酶切會導(dǎo)致載體、LEA自身環(huán)化及LEA反向連接
Luc中存在BamHⅠ識別序列,BamHⅠ會將Luc切斷;一種酶切會導(dǎo)致載體、LEA自身環(huán)化及LEA反向連接
。
(2)為了構(gòu)建基因表達(dá)載體甲,依據(jù)圖中已知堿基序列,在PCR擴(kuò)增儀中加入的引物的堿基序列為
5'-GATATCATGGGC-3'和5'-TCTAGACTAGTG-3'
5'-GATATCATGGGC-3'和5'-TCTAGACTAGTG-3'
,擴(kuò)增
4
4
代后會得到等長的8條DNA片段。
(3)乙酰-CoA羧化酶基因(AC)是油脂合成過程的關(guān)鍵酶基因,甘油三酯酯酶基因(ATGL)是油脂分解過程的關(guān)鍵酶基因。將基因表達(dá)載體甲、乙分別導(dǎo)入植物細(xì)胞培養(yǎng)成轉(zhuǎn)基因植物A、B,在干旱脅迫的環(huán)境下培養(yǎng)兩種轉(zhuǎn)基因植物和正常植物,分別檢測植物體內(nèi)AC和ATGL基因的表達(dá)水平,結(jié)果如圖2。
①在分子水平上,用
抗原-抗體雜交
抗原-抗體雜交
方法檢測AC酶和ATGL酶的含量可得到上述結(jié)果。
②基于以上研究,干旱脅迫基因LEA和VOC在甘藍(lán)型油菜油脂積累中的機(jī)制是
干旱脅迫的環(huán)境下,LEA通過促進(jìn)AC的表達(dá)使植物油脂增加;VOC通過抑制ATGL的表達(dá)減弱油脂的降低
干旱脅迫的環(huán)境下,LEA通過促進(jìn)AC的表達(dá)使植物油脂增加;VOC通過抑制ATGL的表達(dá)減弱油脂的降低
。