為研究干旱脅迫基因LEA和VOC對(duì)甘藍(lán)型油菜油脂的積累機(jī)制，科研人員構(gòu)建了兩個(gè)基因表達(dá)載體。其中基因LEA與熒光素酶基因（Luc）構(gòu)建成基因表達(dá)載體甲，基因VOC和標(biāo)記基因構(gòu)建成基因表達(dá)載體乙，相關(guān)序列及酶切位點(diǎn)如圖1所示。

（1）利用PCR擴(kuò)增LEA基因時(shí)，需要在引物的

5′端

5′端

（填“3′端”或“5′端”）添加限制酶識(shí)別序列，添加序列對(duì)應(yīng)的限制酶是

EcoRⅤ和XbaⅠ

EcoRⅤ和XbaⅠ

，選擇上述酶的依據(jù)是

Luc中存在BamHⅠ識(shí)別序列，BamHⅠ會(huì)將Luc切斷；一種酶切會(huì)導(dǎo)致載體、LEA自身環(huán)化及LEA反向連接

Luc中存在BamHⅠ識(shí)別序列，BamHⅠ會(huì)將Luc切斷；一種酶切會(huì)導(dǎo)致載體、LEA自身環(huán)化及LEA反向連接

。
（2）為了構(gòu)建基因表達(dá)載體甲，依據(jù)圖中已知堿基序列，在PCR擴(kuò)增儀中加入的引物的堿基序列為

5'-GATATCATGGGC-3'和5'-TCTAGACTAGTG-3'

5'-GATATCATGGGC-3'和5'-TCTAGACTAGTG-3'

，擴(kuò)增

4

4

代后會(huì)得到等長(zhǎng)的8條DNA片段。
（3）乙酰-CoA羧化酶基因（AC）是油脂合成過(guò)程的關(guān)鍵酶基因，甘油三酯酯酶基因（ATGL）是油脂分解過(guò)程的關(guān)鍵酶基因。將基因表達(dá)載體甲、乙分別導(dǎo)入植物細(xì)胞培養(yǎng)成轉(zhuǎn)基因植物A、B，在干旱脅迫的環(huán)境下培養(yǎng)兩種轉(zhuǎn)基因植物和正常植物，分別檢測(cè)植物體內(nèi)AC和ATGL基因的表達(dá)水平，結(jié)果如圖2。
①在分子水平上，用

抗原-抗體雜交

抗原-抗體雜交

方法檢測(cè)AC酶和ATGL酶的含量可得到上述結(jié)果。
②基于以上研究，干旱脅迫基因LEA和VOC在甘藍(lán)型油菜油脂積累中的機(jī)制是

干旱脅迫的環(huán)境下，LEA通過(guò)促進(jìn)AC的表達(dá)使植物油脂增加；VOC通過(guò)抑制ATGL的表達(dá)減弱油脂的降低

干旱脅迫的環(huán)境下，LEA通過(guò)促進(jìn)AC的表達(dá)使植物油脂增加；VOC通過(guò)抑制ATGL的表達(dá)減弱油脂的降低

。