44．雞干擾素是一種具有高效和廣譜抗病毒作用的細(xì)胞因子，廣泛用于動物領(lǐng)域的抗病毒治療?？蒲腥藛T將雞干擾素基因作為目的基因，構(gòu)建基因表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草，以獲得抗病毒煙草。如圖為科研人員制備能合成雞干擾素的煙草愈傷組織細(xì)胞的流程，①-④表示相關(guān)的操作，兩種限制酶的識別序列及切割位點(diǎn)如表所示。請回答下列問題：
| 限制酶 |
識別序列和切割位點(diǎn) |
| EcoRⅠ |
 |
| BamHⅠ |
|
（1）步驟①中，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時，設(shè)計引物序列的主要依據(jù)是
?？蒲腥藛T還在兩種引物的一端分別加上了
和
序列，以便于后續(xù)的剪切和連接。
（2）步驟②所構(gòu)建的基因表達(dá)載體中末標(biāo)注出的必需元件還有
，步驟③中需先用
處理農(nóng)桿菌以便將基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。
（3）步驟④中，科研人員提取愈傷組織細(xì)胞的RNA后，先通過逆轉(zhuǎn)錄獲得DNA，再通過PCR擴(kuò)增制備探針，若最終未能檢測出干擾素基因，其可能原因是
。
（4）用煙草花葉病毒對獲得的轉(zhuǎn)基因煙草和普通煙草進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)，接種后第19天對照組植株進(jìn)入病情指數(shù)（植物受病毒侵染的嚴(yán)重程度）為100的平臺期，而轉(zhuǎn)基因植株在第
天才進(jìn)入平臺期，但此時的病情指數(shù)為79，說明轉(zhuǎn)基因煙草植株對病毒的侵染表現(xiàn)出一定的抗性，但抗性較低，可能的原因有
。
