24.中國甜柿的自然脫澀與乙醛代謝關(guān)鍵酶基因(PDC)密切相關(guān),推測澀味程度可能與PDC基因的表達(dá)情況有關(guān)。為篩選PDC基因的調(diào)控蛋白,科研人員構(gòu)建了質(zhì)粒A和質(zhì)粒G( 如圖1、圖2 所示),利用酵母菌進(jìn)行了相關(guān)實驗探究。
(1)啟動子位于基因首端,是
的位點,啟動子區(qū)域還存在著許多調(diào)控蛋白的結(jié)合位點,可影響基因的轉(zhuǎn)錄水平。PDC基因的啟動子序列未知,為獲得大量該基因啟動子所在片段,可利用限制酶將基因組DNA進(jìn)行酶切,然后在
的作用下將已知序列信息的接頭片段連接在PDC基因的上游,根據(jù)接頭片段和PDC基因編碼序列設(shè)計引物進(jìn)行
。
(2)利用質(zhì)粒A構(gòu)建含有PDC基因啟動子片段的重組質(zhì)粒并導(dǎo)入代謝缺陷型酵母菌,用不含
的培養(yǎng)基可篩選出成功轉(zhuǎn)化的酵母菌Y1H。質(zhì)粒G上的AD基因表達(dá)出的AD蛋白與啟動子足夠靠近時,能夠激活后續(xù)基因轉(zhuǎn)錄,因此需獲得待測蛋白與AD蛋白的融合蛋白用于后續(xù)篩選??蒲腥藛T從中國甜柿中提取RNA,將逆轉(zhuǎn)錄形成的各種
與質(zhì)粒G連接后導(dǎo)入酵母菌,此時應(yīng)選擇質(zhì)粒G中的位點
(填序號1~5)作為cDNA的插入位點,最終獲得攜帶不同cDNA片段的酵母菌群Y187。
(3)重組酵母Y187與Y1H能夠進(jìn)行接合生殖,形成的接合子含有兩種酵母菌質(zhì)粒上的所有基因。若接合子能在含有金擔(dān)子素的培養(yǎng)基中生存,則推測待測蛋白是PDC基因的調(diào)控蛋白,請結(jié)合圖3闡述作出該推測的理由
。
(4)篩選出 PDC 基因的調(diào)控蛋白后,為滿足生產(chǎn)上的需要對其進(jìn)行改良,這種技術(shù)屬于
工程,該工程的起點是
。