人溶菌酶（hLTF）是人乳汁中重要的抗菌蛋白。某團隊將hLTF基因連接到質粒載體中構建了hLTF基因表達載體，通過構建轉基因羊乳腺生物反應器生產抗菌蛋白。請回答：
（1）為實現(xiàn)hLTF基因的大量擴增，可利用圖1中的引物 ②③②③組合進行PCR．為保證hLTF基因和表達載體的充分連接，PCR擴增時，應在基因上、下游引物的 5′5′端分別添加相應的酶切位點，且常在兩條引物上設計加入不同的限制酶酶切位點，主要目的是 使DNA片段能定向插入表達載體，減少自連使DNA片段能定向插入表達載體，減少自連。
（2）Cre/loxp位點特異性重組系統(tǒng)可實現(xiàn)轉基因受體細胞染色體（DNA）上基因的定點整合和重組。重組酶Cre能識別特異的DNA序列，即loxP位點，使loxP位點間的基因序列被刪除或重組，Cre/loxp介導三種不同的重組反應。（如圖2）
①loxP位點是一段DNA序列，包括兩個反向重復序列和一個不對稱的間隔區(qū)組成反向重復序列是Cre重組酶的特異識別位點，而間隔區(qū)域決定了loxP位點的方向。Cre酶能特異性地識別反向重復序列并在特定位置切開磷酸二酯鍵，其功能類似于基因工程中的 限制限制酶。
②如果三種重組反應均發(fā)生在染色體上，可能會導致染色體上基因的 缺失、倒位和易位缺失、倒位和易位，重組反應的結果取決于 loxP位點的位置、同一染色體（DNA）上loxP位點的方向loxP位點的位置、同一染色體（DNA）上loxP位點的方向。
（3）構建乳腺生物反應器的方法有多種，一是通過轉基因技術將重組基因導入到受精卵中，使其生長發(fā)育成轉基因動物：二是通過轉基因體細胞核移植技術生產克隆動物作為生物反應器。兩種方法獲得的胚胎都要借助 早期胚胎培養(yǎng)早期胚胎培養(yǎng)技術和 胚胎移植胚胎移植技術才能獲得轉基因動物個體。
【答案】②③；5′；使DNA片段能定向插入表達載體，減少自連；限制；缺失、倒位和易位；loxP位點的位置、同一染色體（DNA）上loxP位點的方向；早期胚胎培養(yǎng)；胚胎移植
【解答】
【點評】
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發(fā)布：2024/6/27 10:35:59組卷：21引用：1難度：0.6
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1．人類基因組計劃測定了人體的24條染色體，這24條染色體是（ ?。?/h2>
發(fā)布：2024/12/31 0:30:1組卷：112引用：7難度：0.7 -
2．學習以下材料，回答（1）～（4）題。
利用抑制性tRNA進行無義突變遺傳病的治療
無義突變是由于某個堿基的改變使代表某種氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子（UAA、UAG或UGA），從而使肽鏈合成提前終止，造成蛋白質的功能改變，引發(fā)相關疾病。約有10%～15%的人類基因相關遺傳疾病是由無義突變引發(fā)的。常規(guī)的基因治療是將正常基因的cDNA序列或是有治療價值的基因（如CRISPR-Cas9相關的基因編輯工具）通過一定的方式導入人體靶細胞內，達到替代或修復缺陷基因、治療疾病的目的。導入基因插入位置不當、過高或過低表達，都可能會導致副作用。盡管基因編輯可以實現(xiàn)生理水平的基因表達，但基因編輯工具引入外源蛋白可能引發(fā)強烈的免疫反應仍然是巨大的挑戰(zhàn)。
抑制性tRNA（sup-tRNA）由天然tRNA改造而來，它的反密碼子通過堿基配對原則可以識別無義突變的終止密碼子，使得mRNA在翻譯至無義突變位點時不啟動翻譯終止而是繼續(xù)向后進行翻譯，獲得有功能的全長蛋白。
I型黏多糖貯積癥的病因，是相關基因發(fā)生無義突變，產生終止密碼子UAG。研究者構建小鼠該突變基因mldua和Flag基因融合的載體（圖1），以及針對該無義突變設計的sup-tRNA表達載體（產生的sup-tRNA能夠識別UAG并攜帶酪氨酸Tyr,簡寫作sup-tRNATyr），將其導入細胞進行研究，發(fā)現(xiàn)與具有相似作用的化合物G418比較，sup--tRNA的作用更加顯著（圖2）；進一步利用重組腺相關病毒作為載體將sup-tRNA導入患病小鼠模型中，實驗顯示能夠降低黏多糖過度積存，實現(xiàn)對該病癥的有效治療，其療效可以持續(xù)半年以上。
從整體來看，G418在促進跨越無義突變位點繼續(xù)翻譯時引入的氨基酸較為隨機，而sup-tRNA引入的氨基酸較為單一，且不會影響內源tRNA穩(wěn)態(tài)，所以sup-tRNA在個體治療中具有很高的安全性，因而在未來基因突變引起的疾病相關治療中具有非常大的應用前景。
（1）侵染時，作為載體的重組腺相關病毒與靶細胞膜上的發(fā)生識別，引發(fā)內吞，進入細胞后釋放單鏈DNA作為模板，利用宿主細胞的催化合成其互補DNA鏈，再經(jīng)過過程產生sup-tRNA。
（2）除了引入的氨基酸較為單一，不影響內源tRNA穩(wěn)態(tài)，我們還可推斷，用于治療的sup-tRNA在正常終止密碼子處（填“能”或“不能”）繼續(xù)往后翻譯，具有很高的安全性。
（3）研究者構建mldua突變基因和Flag基因融合的載體，目的是通過檢測來確定是否跨越無義突變位點繼續(xù)向后翻譯。實驗結果表明，相比于化合物G418，sup-tRNA在促進無義突變位點的翻譯方面更加有效，支持這一結論的依據(jù)是：。
（4）有文獻報道，已在近1000個不同的人類基因中發(fā)現(xiàn)了7500多個無義突變。常規(guī)的基因治療需要為每種疾病設計獨特的治療策略，這將是一項耗費驚人的項目。據(jù)此說明sup-tRNA的應用價值。發(fā)布：2025/1/3 8:0:1組卷：27引用：1難度：0.6 -
3．幾丁質是許多真菌細胞壁的重要成分，自然界有些植物能產生幾丁質酶催化幾丁質水解從而抵抗真菌感染。通過基因工程將幾丁質酶基因轉入沒有抗性的植物體內，可增強其抗真菌的能力。如圖表示為獲取幾丁質酶基因而建立cDNA文庫的過程。
（1）圖示以mRNA為材料通過法獲得cDNA，該方法依據(jù)的原理是，通過這種方法獲得的基因中因缺乏和結構，導致將其直接導入受體細胞中不能復制和表達。
（2）與選用老葉相比，選用嫩葉更容易提取到mRNA，原因是，且提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是。
（3）將從cDNA文庫中獲得的幾丁質酶基因和質粒載體用酶和DNA連接處理后連接起來，構建基因表達載體，DNA連接酶催化形成的化學鍵是。發(fā)布：2025/1/5 8:0:1組卷：5引用：1難度：0.7
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