大麗輪枝菌（一種絲狀真菌）是引起棉花黃萎病的主要病原菌。為觀察大麗輪枝菌對棉花根的侵染路徑，研究人員利用綠色熒光蛋白基因（sGFP）轉(zhuǎn)染大麗輪枝菌，培育出表達綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因菌株，主要過程如圖。分析回答下列問題：

（1）PCR擴增sGFP的原理是

DNA復制

DNA復制

，該過程需要根據(jù)

sGFP兩端的核苷酸序列

sGFP兩端的核苷酸序列

設計特異性引物序列，在PCR反應體系中，添加的dNTP可提供

原料和能量

原料和能量

。
（2）由圖可知：為保證sGFP基因可以在大麗輪枝菌細胞中表達，需將sGFP插入

構(gòu)巢曲霉啟動子和終止子

構(gòu)巢曲霉啟動子和終止子

之間。
（3）圖中b鏈的黏性末端堿基序列（5'→3'）為

AGCT

AGCT

。
（4）過程②需要的工具酶是

DNA連接酶

DNA連接酶

。
（5）過程③中需要配制細菌培養(yǎng)基，配制時要在培養(yǎng)基滅菌并冷卻到80℃左右后，再加入潮霉素溶液，潮霉素不能與培養(yǎng)基一同滅菌的原因是

潮霉素在高溫滅菌時結(jié)構(gòu)會被破壞

潮霉素在高溫滅菌時結(jié)構(gòu)會被破壞

。用該培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)農(nóng)桿菌，得到多個菌落，提取全部細菌質(zhì)粒DNA，用BamHⅠ和HindⅢ完全酶切，可以得到

3

3

種長度不同的DNA片段。
（6）將導入重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌加入大麗輪枝菌的孢子細胞懸液中，在適宜條件下完成轉(zhuǎn)染后利用濾膜過濾得到孢子細胞，再在真菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得菌落，最終通過檢測

大麗輪枝菌細胞中綠色熒光的強度

大麗輪枝菌細胞中綠色熒光的強度

篩選出綠色熒光蛋白旺盛表達的大麗輪枝菌。