表觀遺傳調(diào)節(jié)異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素之一,N6-甲基腺苷(m6A)是真核生物mRNA上最常見的一種修飾。研究發(fā)現(xiàn),胃癌細胞中存在m6A去甲基化酶(ALKBH5)過表達和STC2(癌癥相關(guān)基因)mRNA的m6A修飾水平降低的異?,F(xiàn)象??蒲腥藛T利用基因工程技術(shù)實現(xiàn)ALKBH5基因沉默和STC2基因的過表達,以研究ALKBH5介導(dǎo)的m6A甲基化修飾對胃癌細胞遷移的影響。
(1)已知STC2基因的α鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈,據(jù)圖1分析,利用PCR擴增目的基因時,需要在引物
C
C
的5'端添加BamHⅠ識別序列和強啟動子序列,在引物
B
B
的5'端添加SacⅠ識別序列。
(2)為確保目的基因正確插入質(zhì)粒,需要選擇
BamHⅠ、SacⅠ
BamHⅠ、SacⅠ
限制酶切割質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌體時,可利用潮霉素和卡那霉素篩選出導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌,試簡要表述篩選思路:
依次使用含卡那霉素的培養(yǎng)基和含潮霉素的培養(yǎng)基篩選,能夠在含卡那霉素培養(yǎng)基中生長,而不能在含潮霉素培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌即為導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌
依次使用含卡那霉素的培養(yǎng)基和含潮霉素的培養(yǎng)基篩選,能夠在含卡那霉素培養(yǎng)基中生長,而不能在含潮霉素培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌即為導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌
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(3)研究人員分別用不同方式處理胃癌細胞,并測得胃癌細胞遷移標志蛋白含量如圖3。根據(jù)結(jié)果推測ALKBH5基因影響胃癌遷移的機理是
ALKBH5基因過表達導(dǎo)致ST2基因表達的mRNA去甲基化,進而導(dǎo)致STC2基因過表達而引起癌細胞遷移
ALKBH5基因過表達導(dǎo)致ST2基因表達的mRNA去甲基化,進而導(dǎo)致STC2基因過表達而引起癌細胞遷移
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