小麥純合自交系川農16具有穗大、粒多、抗病等優(yōu)良特性，可通過導入抗除草劑基因bar使其獲得抗除草劑性狀，具體技術路線如圖1所示。其中抗除草劑基因bar來源于野生型植物甲，抗草甘膦基因aroA是選擇標記基因，報告基因能在特定情況特定組織中表達。
（1）圖1中構建表達載體的過程需要用兩種不同的限制酶切割，比用一種限制酶切割的優(yōu)點是

防止目的基因末端任意鏈接、防止目的基因自身環(huán)化、防止目的基因反向連接

防止目的基因末端任意鏈接、防止目的基因自身環(huán)化、防止目的基因反向連接

。很多啟動子具有物種特異性，在圖中Ti質粒的T-DNA中插入除草劑抗性基因bar時其上游啟動子應該選擇

C

C

。
A．野生植物甲啟動子
B．農桿菌啟動子
C．小麥川農16的啟動子
（2）農桿菌轉化愈傷組織時，T-DNA攜帶插入其內的片段轉移到受體細胞。篩選已轉化的愈傷組織，需使用含

除草劑

除草劑

的選擇培養(yǎng)基。但在轉化過程中，愈傷組織表面常殘留農桿菌，導致未轉化愈傷組織也可能在選擇培養(yǎng)基上生長。含有內含子的報告基因只能在真核生物中正確表達，其產物能催化無色物質K呈現(xiàn)藍色。用K分別處理以下愈傷組織，出現(xiàn)藍色的是

②④

②④

（多選）。
①無農桿菌附著的未轉化愈傷組織
②無農桿菌附著的轉化愈傷組織
③農桿菌附著的未轉化愈傷組織
④農桿菌附著的轉化愈傷組織
（3）轉化后經(jīng)篩選的愈傷組織需轉換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，此時培養(yǎng)基需添加的植物激素為

生長素、細胞分裂素

生長素、細胞分裂素

，部分接種在無激素培養(yǎng)基上的芽也能長根，原因是

植物細胞具有全能性，芽頂端合成的生長素向基部運輸，促進根的分化

植物細胞具有全能性，芽頂端合成的生長素向基部運輸，促進根的分化

。培養(yǎng)獲得的轉基因植株不一定穩(wěn)定遺傳，須將轉基因植株進行

自交

自交

，繼續(xù)篩選，最終選育出抗除草劑純合系。
（4）T-DNA序列可隨機插入到愈傷組織DNA中導致插入位點基因功能喪失。上述實驗中偶然獲得了一個突變體F，產量明顯低于小麥川農16。研究者用某種限制酶處理突變體F的DNA，得到圖2，若以此為模板進行PCR擴增出T-DNA插入位置兩側的未知序列，需選擇的引物是

①④

①④

。