家禽體內(nèi)缺少能降解纖維素的酶，影響了家禽對(duì)谷物飼料中纖維素的吸收和利用?？蒲腥藛T將W基因（編碼一種降解纖維素的酶）導(dǎo)入乳酸桿菌細(xì)胞內(nèi)，再將其添加到谷物飼料中，以提高家禽對(duì)纖維素的利用?；卮鹣铝袉?wèn)題。
（1）家禽的胃腸道菌群中，乳酸桿菌占一定的優(yōu)勢(shì)，其細(xì)胞呼吸產(chǎn)生的乳酸等可抑制家禽胃腸道中有害細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖，維持腸道的正常機(jī)能，這體現(xiàn)了乳酸桿菌和家禽間

互利共生

互利共生

的種間關(guān)系。
（2）如圖1是從枯草芽孢桿菌細(xì)胞克隆得到的含W基因的DNA片段，其中乙鏈?zhǔn)寝D(zhuǎn)錄模板鏈；圖2是所用的質(zhì)粒載體。表中EcoRⅠ、BamHⅠ、KpmⅠ、MfeⅠ、HindⅢ是限制酶及其切割位點(diǎn)（均形成黏性末端）。

限制酶	EcoRⅠ	BamHⅠ	KpmⅠ	MfeⅠ	HindⅢ
識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)	5′-G↓AATTC-3′ 3′-CTTAA↑G-5′	5′-G↓GATCC-3 3′CCTAG↓G-5	5′-GGTAC↓C-3 3′-C↑CATGG-5	5′-C↓AATTG-3 3′-GTTAA↑C-5	5′A↓AGCTT-3′ 3′-TTCGA↑A-5′

①為使W基因在乳酸桿菌中表達(dá)，構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，切割含W基因的DNA片段需選用EcoRⅠ和HindⅢ限制酶，切割質(zhì)粒的限制酶需選用

MfeⅠ

MfeⅠ

（填“KpnⅠ”或“MfeⅠ”）和HindⅢ，再通過(guò)DNA連接酶能將W基因與質(zhì)粒進(jìn)行拼接成重組質(zhì)粒，說(shuō)明除HindⅢ外，所選限制酶應(yīng)要滿(mǎn)足的條件是

a.不能破壞目的基因；b.目的基因首尾都要有切點(diǎn)；c.質(zhì)粒要確保至少含有一個(gè)完整的標(biāo)記基因；d.質(zhì)粒上的切點(diǎn)要位于啟動(dòng)子之后、終止子之前；e.目的基因和質(zhì)粒切割后形成的粘性末端還要能互補(bǔ)配對(duì)

a.不能破壞目的基因；b.目的基因首尾都要有切點(diǎn)；c.質(zhì)粒要確保至少含有一個(gè)完整的標(biāo)記基因；d.質(zhì)粒上的切點(diǎn)要位于啟動(dòng)子之后、終止子之前；e.目的基因和質(zhì)粒切割后形成的粘性末端還要能互補(bǔ)配對(duì)

。
②將所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化乳酸桿菌后，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選，得到的乳酸桿菌還需進(jìn)行分子水平檢測(cè)是否導(dǎo)入了W基因，原因是

構(gòu)建的基因表達(dá)載體只含有標(biāo)記基因氨芐青霉素抗性基因，所以應(yīng)使用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選

構(gòu)建的基因表達(dá)載體只含有標(biāo)記基因氨芐青霉素抗性基因，所以應(yīng)使用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選

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（3）對(duì)導(dǎo)入重組質(zhì)粒的乳酸桿菌還需進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的檢測(cè)，以確定目的基因（W基因）是否起作用。檢測(cè)過(guò)程如下：
①配制固體鑒定培養(yǎng)基：除加入水、無(wú)機(jī)鹽、剛果紅、維生素、氮源、瓊脂外，還需要添

纖維素

纖維素

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②將培養(yǎng)的乳酸桿菌、

導(dǎo)入空質(zhì)粒的乳酸菌

導(dǎo)入空質(zhì)粒的乳酸菌

和導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的乳酸桿菌菌液分別接種于固體鑒定培養(yǎng)基上（編號(hào)為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組）。其中Ⅱ組的目的是

排除質(zhì)粒自身的影響

排除質(zhì)粒自身的影響

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③觀察結(jié)果：只有導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的乳酸桿菌在此培養(yǎng)基上出現(xiàn)了

以菌落為中心的透明圈

以菌落為中心的透明圈

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