人們發(fā)現(xiàn)有機磷化合物能有效抑制生物體內的乙酰膽堿酯酶，從而表現(xiàn)出很好的殺蟲、滅鼠效果，但是有機磷化合物會嚴重破壞生態(tài)環(huán)境。甲基對硫磷水解酶（mph）能特異性地與有機磷化合物結合，研究人員利用轉基因技術實現(xiàn)了大腸桿菌高效表達甲基對硫磷水解酶（mph），如圖1所示。請根據(jù)基因工程過程回答以下問題：
（1）構建一株具有全細胞催化活性的大腸桿菌工程菌的關鍵步驟是要構建pET23a-gfp-mph-r的 基因表達載體基因表達載體。構建pET23a-gfp-mph-r過程中應用 Ca2+Ca2+處理使之成為感受態(tài)細胞。研究人員不直接將目的基因mph-r導入大腸桿菌的原因是 使目的基因mph-r能在受體細胞中穩(wěn)定存在和表達使目的基因mph-r能在受體細胞中穩(wěn)定存在和表達。
（2）圖中T7啟動子的功能為 RNA聚合酶識別和結合位點并驅動基因轉錄出mRNARNA聚合酶識別和結合位點并驅動基因轉錄出mRNA。gfp作為一種融合標簽，能很好地提高蛋白的表達量，因此還添加了TEV蛋白酶切位點（TEVsite），其目的是 通過TEV蛋白酶去掉gfp中融合標簽得到大量純的mph-r蛋白通過TEV蛋白酶去掉gfp中融合標簽得到大量純的mph-r蛋白。
（3）為了篩選出具有目的基因的大腸桿菌，應將常規(guī)轉化后的菌液涂布到含 氨芐青霉素（Ampr）氨芐青霉素（Ampr）的LB固體培養(yǎng)基上。
（4）測序成功的表達質粒轉化大腸桿菌用SDS-PAGE電泳檢測全細胞蛋白表達情況，如圖2所示，第4泳道為mph-r單獨表達的表達情況，第5泳道為gfp單獨表達的表達情況，請問：1至3泳道哪一個為融合gfp標簽的mph-r蛋白？為什么？第1泳道，根據(jù)第4泳道m(xù)ph-r蛋白大小約35kD，而第5泳道gfp中蛋白大小約30kD，融合gfp標簽的mph-r蛋白約為65kD，第3泳道不符合。根據(jù)題意，融合gfp標簽后的mph-r的表達量得到顯著提高，所以蛋白表達量更大，應為第1泳道第1泳道，根據(jù)第4泳道m(xù)ph-r蛋白大小約35kD，而第5泳道gfp中蛋白大小約30kD，融合gfp標簽的mph-r蛋白約為65kD，第3泳道不符合。根據(jù)題意，融合gfp標簽后的mph-r的表達量得到顯著提高，所以蛋白表達量更大，應為第1泳道。
【考點】基因工程的操作過程綜合．
【答案】基因表達載體；Ca2+；使目的基因mph-r能在受體細胞中穩(wěn)定存在和表達；RNA聚合酶識別和結合位點并驅動基因轉錄出mRNA；通過TEV蛋白酶去掉gfp中融合標簽得到大量純的mph-r蛋白；氨芐青霉素（Ampr）；第1泳道，根據(jù)第4泳道m(xù)ph-r蛋白大小約35kD，而第5泳道gfp中蛋白大小約30kD，融合gfp標簽的mph-r蛋白約為65kD，第3泳道不符合。根據(jù)題意，融合gfp標簽后的mph-r的表達量得到顯著提高，所以蛋白表達量更大，應為第1泳道
【解答】
【點評】
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發(fā)布：2024/6/27 10:35:59組卷：11引用：3難度：0.5
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（2）為確保目的基因定向插入了質粒，應該選擇（填酶）切割目的基因和質粒。在培養(yǎng)基中加入（填“氨芐青霉素”或“四環(huán)素”）對目的基因進行篩選。
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發(fā)布：2024/12/20 3:30:1組卷：6引用：1難度：0.6
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