真核基因的轉(zhuǎn)錄激活因子是兩種相對獨(dú)立的蛋白質(zhì)BD和AD組成的復(fù)合物,BD負(fù)責(zé)識別基因上游特定的DNA序列并與之結(jié)合(不同基因的BD不同),AD負(fù)責(zé)活化轉(zhuǎn)錄過程,兩者單獨(dú)作用時都不能啟動轉(zhuǎn)錄。在科學(xué)研究中,往往利用該原理判斷兩種蛋白質(zhì)能否相互作用。具 體過程為:讓BD基因與誘餌蛋白基因融合,讓AD基因與待測蛋白基因融合,并讓它們在酵母菌中表達(dá)出相應(yīng)的融合蛋白,若誘餌蛋白與待測蛋白可以相互作用,則AD和BD就能充分接近形成 復(fù)合物,并啟動標(biāo)記基因的表達(dá)。具體過程如圖
(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒甲時使用雙酶切可以有效防止目的基因與質(zhì)粒
自身環(huán)化、反向連接
自身環(huán)化、反向連接
;用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切后,檢測樣品1、2中是否含有重組質(zhì)粒乙,電泳結(jié)果為圖2,其中
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號樣品為成功插入AD-待測蛋白基因的重組質(zhì)粒。
(2)質(zhì)粒導(dǎo)入前,Y2H酵母菌母液需用無菌的Ca
2+處理,推測其目的是
使Y2H酵母菌細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA的生理狀態(tài)
使Y2H酵母菌細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA的生理狀態(tài)
。與原核細(xì)胞相比,由于酵母菌
有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體對蛋白質(zhì)進(jìn)行加工
有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體對蛋白質(zhì)進(jìn)行加工
,故蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象不受影響,這也是選擇其作為受體細(xì)胞的原因之一。
(3)野生型Y2H酵母菌缺乏His3(組氨酸合成基因)和Mell(半乳糖苷酶合成基因),故可將這兩種基因作為標(biāo)記基因?qū)隮2H酵母菌將其制備成受體菌,來判斷誘餌蛋白與待測蛋白能否相互作用。(已知在培養(yǎng)基中含有X-gal的情況下,半乳糖苷酶的分泌可使酵母菌落呈藍(lán)色)。將重組質(zhì)粒甲和乙導(dǎo)入受體菌后,若受體菌菌落在不含組氨酸的平板上能存活且在含有X-gal 的平板上呈現(xiàn)藍(lán)色,則說明誘餌蛋白和待測蛋白能相互作用,理由是
誘餌蛋白與待測蛋白可以相互作用,則AD和BD就能充分接近形成復(fù)合物,并啟動兩種標(biāo)記基因表達(dá)
誘餌蛋白與待測蛋白可以相互作用,則AD和BD就能充分接近形成復(fù)合物,并啟動兩種標(biāo)記基因表達(dá)
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