番茄的果實(shí)營養(yǎng)豐富，具特殊風(fēng)味，是深受人們喜愛的蔬果，但番茄不抗凍，在我國冬季無法栽培?，F(xiàn)有科研人員利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將北極海魚中的抗凍基因轉(zhuǎn)入到了番茄細(xì)胞中，從而培育成功抗凍番茄。導(dǎo)入目的基因的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，圖1為培育過程使用的Ti質(zhì)粒，已知Vir區(qū)的基因活化能促進(jìn)T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移?；卮鹣铝袉栴}：

（1）若經(jīng)過誘變，北極海魚的一條染色體上的抗凍基因發(fā)生了堿基對的替換，導(dǎo)致抗凍能力大大增強(qiáng)，通過瓊脂糖凝膠電泳，能否區(qū)分突變前后的兩個抗凍基因？

不能

不能

，請說明理由

因?yàn)閴A基對的替換，突變前后基因長度相同，無法通過瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分

因?yàn)閴A基對的替換，突變前后基因長度相同，無法通過瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分

。
（2）對于目的基因的獲取，研究人員提取了抗凍蛋白，根據(jù)氨基酸序列分析了mRNA的堿基序列，繼而合成了抗凍基因，通過這種方法得到的目的基因因不含

復(fù)制起點(diǎn)

復(fù)制起點(diǎn)

、

啟動子和終止子

啟動子和終止子

，故無法擴(kuò)增和表達(dá)。選擇圖示Ti質(zhì)粒構(gòu)建基因表達(dá)載體，應(yīng)選擇限制酶

Ⅲ

Ⅲ

（填“Ⅰ”或“Ⅱ”或“Ⅲ”），不選其它限制酶的理由是

限制酶Ⅰ會破壞四環(huán)素抗性基因，影響后續(xù)含目的基因的受體細(xì)胞的篩選，限制酶Ⅱ會破壞Vir區(qū)基因，影響目的基因的轉(zhuǎn)移

限制酶Ⅰ會破壞四環(huán)素抗性基因，影響后續(xù)含目的基因的受體細(xì)胞的篩選，限制酶Ⅱ會破壞Vir區(qū)基因，影響目的基因的轉(zhuǎn)移

。
（3）為篩選成功導(dǎo)入抗凍基因的番茄細(xì)胞，在培養(yǎng)基中添加

四環(huán)素

四環(huán)素

。將篩選后獲得的番茄細(xì)胞經(jīng)

脫分化

脫分化

過程形成愈傷組織后，經(jīng)器官發(fā)生途徑或

體細(xì)胞胚發(fā)生

體細(xì)胞胚發(fā)生

途徑發(fā)育形成植株，再在

低溫/寒冷

低溫/寒冷

條件下篩選出具有抗凍性狀的番茄植株。
（4）研究人員想比較不同轉(zhuǎn)基因番茄中抗凍蛋白的合成量，制備相應(yīng)的單克隆抗體，利用圖2所示原理進(jìn)行檢測。
①檢測前，先將抗凍蛋白的單克隆抗體固定在支持物上，然后向該檢測體系中加入一定量的番茄植株中提取的蛋白質(zhì)（待測抗原）和等量酶標(biāo)記抗凍蛋白（酶標(biāo)記抗原），目的是讓待測抗原、酶標(biāo)記抗原與抗體

競爭性

競爭性

結(jié)合。
②保溫一段時間后洗滌，再向檢測體系中加入一定量的白色底物，若檢測體系藍(lán)色越

淺

淺

，則說明番茄提取物中抗凍蛋白的含量越高。
③本檢測方法中的單克隆抗體可經(jīng)雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔克隆化培養(yǎng)后，分別從

細(xì)胞培養(yǎng)液

細(xì)胞培養(yǎng)液

、

小鼠腹水

小鼠腹水

中提取。