土壤鹽漬化影響水稻生長發(fā)育,將水稻耐鹽堿基因OsMYB56導入不耐鹽堿水稻品種吉粳88中,培育耐鹽堿水稻新品種,其操作流程及可能用到的限制酶如圖,其中bar為抗除草劑基因,Tet
r為四環(huán)素抗性基因,Amp
r為氨芐青霉素抗性基因,①~⑦表示操作過程。
限制酶 |
BamHⅠ |
BclⅠ |
SmaⅠ |
Sau3AⅠ |
識別位點及切割位點 |
-G↓GATCC- |
-T↓GATCA- |
-CCC↓GGG- |
-↓GATC- |
(1)OsMYB56基因游離的磷酸基團側為
5'
5'
(“5'”或“3'”)端,過程①PCR擴增OsMYB56基因時加入的酶催化
磷酸二酯(鍵)
磷酸二酯(鍵)
鍵的形成,還需要添加引物,應選用引物組合
①④
①④
。
①5'-CTTGGATGAT-3'
②5'-TAAGTTGTCT-3'
③5'-TAGTAGGTTC-3'
④5'-TCTGTTGAAT-3
⑤5'-ATTCAACAGA-3'
⑥5'-ATCATCCAAG-3'
(2)根據(jù)基因表達載體的結構組成分析,Ti質粒中的CaMV35S是
啟動子
啟動子
,其功能是
RNA聚合酶識別和結合的部位,(啟動轉錄過程)
RNA聚合酶識別和結合的部位,(啟動轉錄過程)
?;虮磉_載體中,OsMYB56基因和bar基因編碼鏈的方向
相反
相反
(填“相同”或“相反”)。
(3)過程③應選用限制酶
BclⅠ和SmaⅠ
BclⅠ和SmaⅠ
切割質粒,利用所選限制酶進行操作的優(yōu)勢是
防止酶切后的質粒自身環(huán)化,保證OsMYB56和酶切后的質粒定向連接
防止酶切后的質粒自身環(huán)化,保證OsMYB56和酶切后的質粒定向連接
,切割后需要用
T4DNA連接酶
T4DNA連接酶
進行連接才能獲得重組質粒。
(4)為了篩選出含重組質粒的受體細胞,④過程應在添加
四環(huán)素
四環(huán)素
的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)后獲得的菌落不能判定是否含有重組質粒,原因是
含未重組Ti質粒(或普通Ti質粒)的受體細胞也能正常生長
含未重組Ti質粒(或普通Ti質粒)的受體細胞也能正常生長
。