COR基因是植物的冷調(diào)節(jié)基因，其編碼的親水性多肽能保護細胞免受凍害，具有增強植物抗寒性的作用。轉(zhuǎn)錄因子CBF（由CBF基因控制合成）能夠特異性結(jié)合下游靶基因啟動子區(qū)，從而激活COR基因的表達以提高植物的抗寒性。將不同植物中獲取的CBF基因和COR基因組合起來構(gòu)建抗寒基因超量表達載體，轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)能有效提高植物的低溫耐受性。構(gòu)建基因表達載體時需要根據(jù)載體和目的基因上的限制酶切割位點選擇不同的限制酶，當遇到平末端和黏性末端不能連接時，可利用限制酶Klenow酶特有的5'→3'DNA聚合酶活性，將黏性末端補平后再與平末端連接。
（1）研究小組獲取了一段包含CBF基因的長DNA片段，根據(jù)已知CBF基因序列設計了適宜長度的引物A和引物B，則在PCR反應過程中需要經(jīng)過
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次復制才會出現(xiàn)與CBF基因長度和序列完全吻合的產(chǎn)物；經(jīng)過四次循環(huán)形成的產(chǎn)物中同時含有A引物和B引物的DNA占 。
（2）抗寒相關(guān)基因超量表達依賴于適宜的啟動子。啟動子可分為組成型啟動子（每種組織器官中均發(fā)揮作用）、組織特異型啟動子（特定組織器官中才能發(fā)揮作用）和誘導型啟動子（特定條件刺激才能發(fā)揮作用），構(gòu)建基因表達載體時可單獨使用某一類型的啟動子也可多種類型組合使用。從減少物質(zhì)和能量消耗的角度出發(fā)，最好選擇 塊莖組織特異型啟動子和冷刺激誘導
塊莖組織特異型啟動子和冷刺激誘導
類型啟動子使馬鈴薯塊莖在寒冷刺激下才啟動抗寒基因的表達。
（3）為將COR基因表達載體和CBF基因組合起來構(gòu)建抗寒基因超量表達載體，應選擇不同的限制酶分別切割COR基因表達載體和CBF基因的兩端，目的是 保證COR基因表達載體和CBF基因的正確連接（避免CBF基因和COR基因表達載體的自身環(huán)化以及CBF基因的反向連接）
保證COR基因表達載體和CBF基因的正確連接（避免CBF基因和COR基因表達載體的自身環(huán)化以及CBF基因的反向連接）
。根據(jù)下圖所示限制酶切割位，點和識別序列，實驗室中構(gòu)建抗寒基因超量表達載體時，為實現(xiàn)經(jīng)Xbal切割后的CBF基因與COR基因表達載體的連接，應選用的限制酶是 SamI、Klenow酶
SamI、Klenow酶
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（4）轉(zhuǎn)錄因子CBF特異性識別下游靶基因啟動子區(qū)后，可能與 RNA聚合
RNA聚合
酶結(jié)合形成復合體從而激活COR基因的表達。
（5）科學家成功培育出抗寒基因超量表達的轉(zhuǎn)基因植物后，篩選到一個AtNUP160基因突變的植株（atnup160突變體），已知AtNUP160基因表達產(chǎn)物能通過參與核孔復合體的形成影響RNA的出核轉(zhuǎn)運，在植物抗寒過程中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，atnup160突變體中CBF基因的表達水平降低，進而影響了COR基因的表達，植物抗寒能力減弱。由此推斷atnup160突變體抗寒能力減弱的機理是 atnup160突變體中AtNUP160基因表達產(chǎn)物減少，影響核孔復合體的形成，導致CBF基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA無法轉(zhuǎn)運出核，轉(zhuǎn)錄因子CBF減少，使得COR基因的表達水平明顯降低，產(chǎn)生保護細胞免受凍害的親水性多肽減少，植物抗寒能力減弱
atnup160突變體中AtNUP160基因表達產(chǎn)物減少，影響核孔復合體的形成，導致CBF基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA無法轉(zhuǎn)運出核，轉(zhuǎn)錄因子CBF減少，使得COR基因的表達水平明顯降低，產(chǎn)生保護細胞免受凍害的親水性多肽減少，植物抗寒能力減弱
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