基因定點(diǎn)整合可替換特定基因，該技術(shù)可用于單基因遺傳病的治療。苯丙酮尿癥是由某基因（A）突變引起的，將正常A基因定點(diǎn)整合到A基因突變的小鼠胚胎干細(xì)胞的染色體DNA上，替換突變基因，可用來研究該病的基因治療過程?；蚨c(diǎn)整合的過程如圖所示，已知neor基因可作為標(biāo)記基因，含有neor的細(xì)胞具有對(duì) G418 的抗性?；卮鹣铝袉栴}：

（1）構(gòu)建重組載體，常用的工具酶有

限制酶和DNA連接酶

限制酶和DNA連接酶

。構(gòu)建重組載體時(shí)，需要大量A基因，常用

PCR

PCR

技術(shù)合成A基因，利用該方法合成A基因時(shí)需要設(shè)計(jì)并合成

2

2

種引物。
（2）將重組載體導(dǎo)入患病小鼠胚胎干細(xì)胞的常用方法為

顯微注射法

顯微注射法

。檢測(cè)患病小鼠胚胎干細(xì)胞中是否導(dǎo)入重組載體的方法是在含有

G418

G418

的培養(yǎng)液中培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞。
（3）用圖中重組載體轉(zhuǎn)化胚胎干細(xì)胞時(shí)，會(huì)出現(xiàn)A基因錯(cuò)誤整合。錯(cuò)誤整合時(shí)，重組載體上的兩個(gè)HSV-tk至少會(huì)有一個(gè)neor一起整合到染色體DNA上。已知HSV-tk1、HSV-tk2的產(chǎn)物都把DHPG轉(zhuǎn)化成有毒物質(zhì)而使細(xì)胞死亡。將導(dǎo)入重組載體胚胎干細(xì)胞置于同時(shí)含有G418和DHPG的培養(yǎng)，存活下來的是

正確整合

正確整合

（填“正確整合”或“錯(cuò)誤整合”）的胚胎干細(xì)胞。
（4）將上述篩選得到的胚胎干細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因克隆小鼠，還需要

核移植

核移植

技術(shù)

早期胚胎培養(yǎng)

早期胚胎培養(yǎng)

技術(shù)和

胚胎移植

胚胎移植

技術(shù)。