研究表明來源于大腸桿菌的蘇氨酸輸出蛋白（由rhtA基因編碼）能夠識別5-氨基乙酰丙酸，并將其輸出至細(xì)胞外。為探究蘇氨酸輸出蛋白對5-氨基丙酸合成的影響，研究人員從大腸桿菌的基因組DNA中擴(kuò)增出rhtA基因，并構(gòu)建出相應(yīng)的重組質(zhì)粒，獲得轉(zhuǎn)rhtA基因的工程菌，其基本操作流程如圖1所示，已知引物A、B的序列分別是：5′-AGGAAACAGACCATGGAATTCATGCCTGGTTCATTACGTAAAATG-3′、5′-GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTAATTAATGTCTAATTCTTTTATTTTGCTC-3′。

回答下列問題：
（1）由圖可知，獲取大量rhtA基因要經(jīng)PCR技術(shù)擴(kuò)增，若要擴(kuò)增出N個rhtA基因，需要引物A、B各

N-1

N-1

個，對引物A的設(shè)計要求是

不能自身成環(huán)、不能與引物B互補配對、長度要適中

不能自身成環(huán)、不能與引物B互補配對、長度要適中

（答出2點即可）；通過過程①得到重組質(zhì)粒，需選用的兩種限制酶是

EcoRⅠ和HindⅠ

EcoRⅠ和HindⅠ

，兩者起作用部位的化學(xué)鍵是

磷酸二酯鍵

磷酸二酯鍵

。
（2）過程②⑤在操作時，一般需用鈣離子處理大腸桿菌細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種

感受態(tài)細(xì)胞

感受態(tài)細(xì)胞

的生理狀態(tài)。過程③將大腸桿菌體內(nèi)的質(zhì)粒提取出來進(jìn)行驗證時，以EeoRⅠ切割pEC-XK99E質(zhì)粒為對照，分別對重組質(zhì)粒用EcoRⅠ單酶切、以（1）選用的雙酶對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，然后用電泳技術(shù)進(jìn)行驗證，其實驗結(jié)果如圖2所示，若2是對照，則3、4分別是單酶切、雙酶切的結(jié)果，做出此推測的依據(jù)是

用EcoRⅠ單酶切對照和重組質(zhì)粒，均使質(zhì)粒成為線形，2的DNA條帶略比3小，是因為3多了一段rhtA基因序列，4被雙酶切后形成兩個DNA片段，此兩段DNA的大小相加剛好與3基本相同

用EcoRⅠ單酶切對照和重組質(zhì)粒，均使質(zhì)粒成為線形，2的DNA條帶略比3小，是因為3多了一段rhtA基因序列，4被雙酶切后形成兩個DNA片段，此兩段DNA的大小相加剛好與3基本相同

。
（3）將正確的質(zhì)粒導(dǎo)入A19后，后續(xù)的步驟是

目的基因的檢測與鑒定

目的基因的檢測與鑒定

。本技術(shù)選用微生物大腸桿菌作為受體細(xì)胞，而不選用動物細(xì)胞，理由是

微生物繁殖速度快，可在短時間內(nèi)獲得大量基因表達(dá)的產(chǎn)物

微生物繁殖速度快，可在短時間內(nèi)獲得大量基因表達(dá)的產(chǎn)物

（答出一點即可）。