某實(shí)驗(yàn)室需構(gòu)建含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）基因的表達(dá)載體用于科學(xué)研究。相關(guān)資料如下：
①雙鏈DNA的每一條鏈有兩個(gè)末端，分別是5′端和3′端，從左到右的5′-3′DNA鏈?zhǔn)蔷幋a鏈，從左到右的3′-5′DNA鏈?zhǔn)悄０彐湣?br />②增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）在自然光下顯示綠色，已知該基因的DNA編碼序列如下：5′ATGGTGAGC……AAGTAA3′。
③質(zhì)粒載體中含有EcoRⅠ、HindⅢ、BamHI、XbaⅠ和NotⅠ等酶的酶切位點(diǎn)（這些酶各自的識(shí)別序列不同），如圖所示。
回答下列問題：
（1）增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)錄的mRNA堿基序列為

5’AUGGUGAGC……AAGUAA3’

5’AUGGUGAGC……AAGUAA3’

。
（2）通過PCR方法獲得eGFP目的片段，首先需要設(shè)計(jì)

一對(duì)

一對(duì)

（填“一對(duì)”或“一個(gè)”）引物，在體外選擇性擴(kuò)增eGFP目的片段，PCR反應(yīng)一般由95℃熱變性、55～60℃引物和模板配對(duì)、72℃延伸三個(gè)步驟，經(jīng)過多次循環(huán)完成。延伸階段選用72℃是綜合考慮了兩個(gè)因素，這兩個(gè)因素是

防止DNA變性

防止DNA變性

和

保存Taq酶所需溫度條件

保存Taq酶所需溫度條件

。
（3）eGFP的PCR產(chǎn)物兩端分別含有BamHⅠ和NotⅠ的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，用這兩種酶酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體。與單一酶酶切相比，該實(shí)驗(yàn)采用的雙酶切方法的優(yōu)點(diǎn)是

防止目的基因與質(zhì)粒任意連接

防止目的基因與質(zhì)粒任意連接

（答一點(diǎn)即可）。
（4）將所構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，涂布含有卡那霉素的平板，若表達(dá)載體構(gòu)建成功，可觀察到多個(gè)

綠色熒光

綠色熒光

單菌落。