一種天然蛋白t-PA能高效降解因血漿纖維蛋白凝聚而成的血栓,是心梗和腦血栓的急救藥,但是心梗患者注射大劑量的t-PA會誘發(fā)顱內(nèi)出血。研究證實(shí),將t-PA蛋白第84位的半胱氨酸換成絲氨酸,能顯著降低其誘發(fā)出血的副作用。據(jù)此,先對天然t-PA基因的堿基序列進(jìn)行改造,然后再采取傳統(tǒng)的基因工程方法表達(dá)該改造后的基因,可制造出性能優(yōu)異的改良t-PA蛋白。如圖表示相關(guān)的目的基因、載體及限制酶識別序列和切割位點(diǎn),pCLY11為質(zhì)粒,請回答下列問題:
(1)可以先提取細(xì)胞的
mRNA
mRNA
來合成總cDNA,再從cDNA文庫中獲取t-PA基因。通過改造t-PA基因制造出性能優(yōu)異的改良t-PA蛋白的過程被稱為
蛋白質(zhì)
蛋白質(zhì)
工程。
(2)若改造后的t-PA基因的黏性末端如上圖所示,則需要選用限制酶
XmaⅠ和BglⅡ
XmaⅠ和BglⅡ
切割質(zhì)粒pCLY11,保證質(zhì)粒與t-PA改良基因高效連接。再用DNA連接酶催化形成
磷酸二酯
磷酸二酯
鍵,構(gòu)建重組質(zhì)粒。
(3)以大腸桿菌作為受體細(xì)胞,在含新霉素的培養(yǎng)基中形成菌落的受體細(xì)胞并非都是目的菌株,原因是
導(dǎo)入未連目的基因的質(zhì)粒的大腸桿菌也可以在這種培養(yǎng)基上生長
導(dǎo)入未連目的基因的質(zhì)粒的大腸桿菌也可以在這種培養(yǎng)基上生長
。成功獲取能生產(chǎn)改良t-PA蛋白的工程菌株后,利用
液體
液體
(填“固體”或“液體”)培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中進(jìn)行大量生產(chǎn)。
(4)除了用工程菌株,還可以用下列方法從轉(zhuǎn)基因牛乳汁中獲得改良t-PA蛋白:
過程②常用的方法是
顯微注射法
顯微注射法
;在過程④前需要取囊胚的
滋養(yǎng)層
滋養(yǎng)層
細(xì)胞做DNA分析進(jìn)行性別鑒定;為了保證t-PA改良基因能在乳腺細(xì)胞中表達(dá),構(gòu)建基因表達(dá)載體需要將其與
乳腺蛋白基因的啟動子
乳腺蛋白基因的啟動子
等調(diào)控元件重組在一起。