25.蜂毒肽又稱蜂毒溶血肽,是蜂毒的主要活性成分之一,在抗菌、消炎、抗腫瘤乃至肌肉再生等方面具有一定應(yīng)用價值。蜂毒前溶血肱原是prepromelittin基因(以下簡稱PL基因)的表達(dá)產(chǎn)物,在蜜蜂體內(nèi)合成后首先加工成蜂毒溶血肽原(蜂毒肽前體蛋白),其可被進(jìn)一步水解而形成蜂毒肽。與蜂毒肽相比,蜂毒前溶血肽原具有較大的溶解度,且對細(xì)胞的破壞能力小,可以考慮利用基因工程方法在體外合成蜂毒肽的前體產(chǎn)物。
(1)生產(chǎn)蜂毒肽常選用微生物做受體細(xì)胞,優(yōu)點是
;通過原核細(xì)胞
(填“能”或“不能”)直接獲得蜂毒肽嗎,原因是
。
(2)為了解決(1)中的問題,對蜂毒前溶血肽原基因進(jìn)行改造(如圖1),以便于后期用羥胺(一種能專一性裂解特定兩個氨基酸之間肽鍵的化合物)對生產(chǎn)出的蜂毒前溶血肽原進(jìn)行裂解獲得蜂毒肽。觀察圖1可知,改造后的DNA序列長度為
bp,根據(jù)改造前后氨基酸序列的變化推測羥胺的識別位點是
,獲得該位點操作是
。除此之外,與原DNA序列相比,改造后的序列中刪除了Gly的對應(yīng)序列
,推測刪除的理由是
。
注;圖中所示的“原DNA序列”為蜂毒前溶血肽原的編碼區(qū)序列的編碼鏈,即轉(zhuǎn)錄時所用模板鏈的互補(bǔ)鏈。①甲硫氨酸,縮寫為M,由起始密碼子AUG編碼;②丙氨酸(Asn),縮寫為N;③甘氨酸(Gly),縮寫為G,由密碼子GGU、GGC、GGA、GGG編碼。
(3)根據(jù)改造后的基因序列,利用人工化學(xué)合成方法進(jìn)行全基因合成,設(shè)計并合成引物對合成基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將PCR產(chǎn)物和pGEX-4T-1載體利用
酶進(jìn)行基因表示載體的構(gòu)建,獲得蜂毒前溶血肽原與GST(一種標(biāo)簽蛋白)融合表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel(見圖2)。已知擴(kuò)增PL基因時設(shè)計的一條引物的序列是:引物M1:5′-GACACGAATTC-3′,已知EcoRⅠ的識別序列是GAATTC,請續(xù)寫出該引物的后8個堿基
。