17．人類γ基因啟動(dòng)子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A蛋白后，γ基因的表達(dá)被抑制。通過改變?cè)摻Y(jié)合位點(diǎn)的序列，解除對(duì)γ基因表達(dá)的抑制，可對(duì)某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療。科研人員擴(kuò)增了γ基因上游不同長(zhǎng)度的片段，將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測(cè)，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。
（1）圖中啟動(dòng)子是
識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)，且啟動(dòng)子是具有方向性的，目的基因只有正確插入啟動(dòng)子和終止子之間才能正確表達(dá)。在表達(dá)載體中綠色熒光蛋白基因作為
，要使其成功表達(dá)，圖b中還缺啟動(dòng)子，請(qǐng)判斷即將插入的啟動(dòng)子方向
（填“向左”或“向右”）。
（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增γ基因上游不同DNA片段的原理是
，為使PCR反應(yīng)體系中的模板解鏈為單鏈，需要滿足的條件是
。
（3）將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)綠色熒光蛋白基因表達(dá)，需要在引物末端添加限制酶識(shí)別序列。據(jù)圖可知，在R末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶應(yīng)為
，在F1～F7末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是
。
（4）從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過程中，除限制酶外，還必須用到的工具酶有DNA連接酶和
。
（5）將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細(xì)胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)1～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白，受體細(xì)胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光。含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光的原因是
。
（6）向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含F(xiàn)1～F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，而含F(xiàn)5～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對(duì)應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列，據(jù)此結(jié)果可推測(cè)，BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于
。
