31．神經(jīng)生長因子（NGF）對神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化有重要作用，對非神經(jīng)性細(xì)胞的生長和活性有輔助作用，對神經(jīng)性和非神經(jīng)性疾病都有良好的潛在治療作用?？蒲腥藛T通過轉(zhuǎn)基因方法制備能在腮腺中特異性表達(dá)人源神經(jīng)生長因子（hNGF）的轉(zhuǎn)基因豬，并采集該轉(zhuǎn)基因豬分泌的唾液，分離純化hNGF用于人類神經(jīng)性疾病的治療。回答下列問題：
（1）步驟一：將hNGF基因序列替換位于載體XhoⅠ和NotⅠ酶切位點之間的序列，構(gòu)建含人源NGF的基因表達(dá)載體。該步驟中選擇XhoⅠ和NotⅠ兩種限制酶的優(yōu)點是
，在hNGF基因的兩端也必須含有XhoⅠ和NotⅠ酶識別的序列，添加的方法是
。
（2）步驟二：將基因表達(dá)載體導(dǎo)入豬胎兒成纖維細(xì)胞。該步驟使用的方法是
，目的是
。
（3）步驟三：重構(gòu)胚的構(gòu)建。篩選成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的豬胎兒成纖維細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，該過程中會出現(xiàn)
的現(xiàn)象，需要用胰蛋白酶進(jìn)行處理并及時分瓶培養(yǎng)。獲得的細(xì)胞作為核供體注入
中。
（4）步驟四：轉(zhuǎn)基因克隆豬的獲得。重構(gòu)胚發(fā)育到
后經(jīng)胚胎移植導(dǎo)入代孕豬子宮內(nèi)，獲得的轉(zhuǎn)基因豬的遺傳物質(zhì)來自
。
