PHB2蛋白具有抑制細胞增殖的作用。為初步探究某動物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡稱phb2基因），大小為0.9kb（1kb=1000堿基對），利用大腸桿菌表達該蛋白。回答下列問題：
相關限制酶的識別序列及切割位點（注：箭頭表示切割位點）

名稱	識別序列及切割位點	名稱	識別序列及切割位點
HindⅢ	A↓AGCTT TTCGA↑A	EcoRⅠ	G↓AATTCCTTAA↑G
PvitⅡ	CAG↓CTGGTC↑GAC	PstⅠ	CTGC↓AG GA↑CGTC
KpnⅠ	G↓GTACCCCATG↑G	BamHⅠ	G↓GATCCCCTAG↑G

（1）圖1為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識別序列及切割位點見表。為使phb2基因（該基因序列不含圖1中限制酶的識別序列）與載體正確連接，在擴增的phb2基因兩端分別引入 和 兩種不同限制酶的識別序列。對于酶切的phb2基因和載體進行連接，選擇兩種限制酶切比用一種限制酶切好的原因：。

注：M為指示分子大小的標準參照物；小于0.2kb的DNA分子條帶未出現(xiàn)在圖中
（2）將轉化后的大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，隨機挑取單菌落（分別編號為1、2、3、4）培養(yǎng)并提取質粒，用（2）中選用的兩種限制酶進行酶切，酶切產物經電泳分離，結果如圖2，號菌落的質粒很可能是含目的基因的重組質粒。
（3）根據PHB2cDNA的核苷酸序列設計了相應的引物如圖，通過PCR擴增PHB2基因。已知A位點和B位點分別是起始密碼子和終止密碼子對應的基因位置。選用的引物組合應為 ，pcr擴增時選取的DNA往往類似于圖，而目的基因往往只是其中的一個片段類似于AB段，當pcr擴增至第四輪循環(huán)時等長的目的基因片段占 。

【考點】基因工程的原理．

【答案】EcoRⅠ和；PvitⅠ；可以防止目的基因和質粒的自身環(huán)化，也可以防止目的基因和質粒的反向連接；3；引物1和引物4；