科研人員利用大腸桿菌構(gòu)建了抗蟲(chóng)基因文庫(kù)。最新研究發(fā)現(xiàn)漏斗蜘蛛中的AH基因控制合成的毒素肽具有顯著的殺蟲(chóng)效果，現(xiàn)以p-B質(zhì)粒為載體，構(gòu)建 AH基因的cDNA文庫(kù)。圖1表示p-B質(zhì)粒，其中Cm/表示氯霉素抗性基因，cdB 基因表達(dá)產(chǎn)物能抑制大腸桿菌 DNA 復(fù)制。圖中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，且不同種限制酶識(shí)別序列不同，其中AiuI、XbaI、SspI和MfeⅠ識(shí)別的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別是 AG'CT、T'CTAGA、AAT'ATT、C'AATTG。請(qǐng)分析并回答下列問(wèn)題：

（1）為獲得AH基因的cDNA，先要從漏斗蜘蛛毒素肽分泌細(xì)胞中提取

RNA

RNA

，再通過(guò)

反轉(zhuǎn)錄

反轉(zhuǎn)錄

合成出AH基因的cDNA。若從漏斗蜘蛛其他組織細(xì)胞提取，則難以成功，原因是

AH基因在其他組織細(xì)胞中不表達(dá)，（提取不到AH基因的RNA）

AH基因在其他組織細(xì)胞中不表達(dá)，（提取不到AH基因的RNA）

。
（2）若已知AH基因的cDNA兩端部分序列為：5'-AACTATGCGC……CGTAGCCTCT-3'，請(qǐng)寫(xiě)出PCR擴(kuò)增該cDNA時(shí)的兩個(gè)引物對(duì)應(yīng)的局部序列（前10個(gè)堿基序列），并標(biāo)明5'和3'端：

5'-AACTATGCGC-3'

5'-AACTATGCGC-3'

，

5'-AGAGGCTACG-3'

5'-AGAGGCTACG-3'

。一個(gè)初始雙鏈cDNA經(jīng)四輪循環(huán)后，共消耗這兩種引物的數(shù)量為

30

30

個(gè)。
（3）利用圖中的質(zhì)粒和AH基因構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，宜選用限制酶

Aiu I和Mfe l

Aiu I和Mfe l

雙酶切質(zhì)粒，再選用限制酶

Ssp I和Me I

Ssp I和Me I

切割目的基因，將切割后獲得的DNA片段混合，經(jīng)DNA連接酶處理后，再與大腸桿菌混合培養(yǎng)，在含有適量氯霉素的培養(yǎng)基中添加適量冷的

CaCl₂

CaCl₂

，以促進(jìn)轉(zhuǎn)化。
（4）經(jīng)上述處理培養(yǎng)后，其中能繁殖的大腸桿菌中應(yīng)含有的質(zhì)粒是

重組質(zhì)粒（及ccdB基因被破壞的空白質(zhì)粒）

重組質(zhì)粒（及ccdB基因被破壞的空白質(zhì)粒）

，原因是

質(zhì)粒中的ccdB基因被破壞，不能抑制DNA復(fù)制

質(zhì)粒中的ccdB基因被破壞，不能抑制DNA復(fù)制

。